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Nisin的发酵生产条件和纯化研究 作者：葛亚中　… 文章来源：China Food Additiv 点击数：617 更新时间：2007-12-3 21:37:27 　　Nisin,又称为乳酸链球菌素,乳酸链球菌肽或尼可素,是由某些乳酸菌(Lacrococcus lactis)在代谢过程中合成的小分子肽,其成熟分子仅含有34个氨基酸残基;在天然状态下,Nisin主要有两种形式,分别为NisinA和NisinZ,它们之间的差别仅在于氨基酸序列中第27位的氨基酸不同,在NisinA中是组氨酸,在NisinZ中是天冬氨酸。NisinA的结构如图1所示: 　　Nisin可以抑制食品中革兰氏阳性菌的生长,如微球菌、分枝杆菌、棒杆菌、葡萄球菌和乳酸菌等,对于梭状芽孢杆菌也有很好的抑制作用,能有效阻止孢子的萌发和毒素的生成。Nisin对革兰氏阴性菌基本无影响,但通过和某些络合剂(如ED-TA或柠檬酸)等协同作用抑制之。因此,Nisin可显著的延长食品的保存时间或缩短杀菌所需的时间,在乳制品、肉制品、罐装食品及植物蛋白食品等的保藏与防腐方面都有很好的作用。对Nisin毒理和生物学的研究表明,使用Nisin的安全性较高。它的半致死剂量(LD50)约为7g/kg,与普通食盐相近。1969年FAO/WHO批准Nisin为食品添加剂,到目前为止,已有50多个国家和地区批准使用,这也是现阶段唯一被许可用于防腐剂的细菌素(bacteriocin)。 1953年,Nisin开始工业化生产,当时最大的生产者是英国的AplinBarrett公司,其产品Nisaplin的效价为1×106IU/g(1IU相当于0. 025μg纯Nisin)。丹麦Chr Hansen公司生产的Nisin制品-Chrisin,效价为0.9×106IU/g。 一、Nisin的发酵生产 Nisin的生产是和生长密切相关,它通常发生在整个生长阶段。从新陈代谢的角度来看,Nisin通常被认为是基础代谢物,也就是说,产率仅依赖生长率。但即使Nisin的生产和生长相联系,由于许多影响其生产和吸附的因子之间的相互作用,细胞达到最大生物量时并不一定会使Nisin有最大产量。这可通过细菌素积累模型(方程式1)进行说明: rp=αrx+βX　　　　　　　　　　(1) 式中:γp和γx:分别指细菌素的产率和菌体的生长率;α和β是需要在实验中确定的参数。 将(1)式变形,即得: rp X=αrXX+β;即rpX=αμ+β　　　　(2) 这样,生物代谢可以分为3类: ①基础代谢:当β=0时,细菌素产率仅由菌体生长率所决定; ②二级代谢:当α=0时,细菌素产率仅由菌体数量所决定; ③综合代谢:当β≠0,α≠0时,细菌素产率由菌体生长率和数量共同决定。对于某些细菌素而言,产率和细胞的生长率确实是呈近似的线性关系的,也就是说,它们是近似符合基础代谢的;但是,人们观察到:不论是连续生产还是分批间歇发酵,Nisin的产率和细胞的生长的非线性关系非常明显。分批发酵中,菌体指数生长阶段后期,Nisin的合成增加,显然和细胞生长不一致。Barcena等人认为,由于nis基金在指数生长初期就有表达,因此Nisin产量在生长后期的增长,是基于碳源对Nisin前体修饰基因的表达与活性调节。 1　培养基 Nisin的发酵生产主要是在乳酸链球菌菌株培养基加碳源(通常是蔗糖)、氮源(如蛋白胨、酵母粉)、无机盐类,吐温等得到。发酵的效果主要受到碳源和氮源的影响,磷酸盐、阳离子、表面活性剂和抑制剂的种类和含量对生产也有很大影响。 1.1　碳源 Nisin生产常用的碳源有蔗糖,葡萄糖等。实际生产中,蔗糖被证明是最好的碳源;果糖和乳糖可以产生相当大的生物量,但是Nisin的产量却很低。在控制pH的分批发酵中,单位生物量的Nisin产量和终了时的Nisin浓度都受到初始糖浓度的影响。Devuyst等人曾以蔗糖为碳源,培养乳酸链球菌亚种NIZO22186(Lc.lactissubsp.lactisNIZO22186),在蔗糖浓度为30g/L时,Nisin的单位产量最大。但是,当随着蔗糖浓度从30 g/L增加到40g/L时,即使有更多的生物量产生,单位生物量生产的Nisin还是从19.1mg/L减少到10.9mg/L,这可通过碳源对Nisin前体(prenisin)修饰基因的表达和活性的调节来解释。M.L.Cabo等注意到,当为Nisin的生产在遵循某个pH变化达到最大的生产效率的时候,仅有20%的蛋白质被消耗,而葡萄糖则被完全消耗。因此他们认为,定期的加入葡萄糖将对生产有利。这个结论在随后的试验得到了证明。对于其它的碳源也有相似的结果。由此我们可以确定,间歇补充碳源有利于提高Nisin产量。 1.2　氮源 乳酸菌是对营养非常挑剔的微生物,菌体生