Dmrt1基因cDNA序列的克隆及分析.doc

Dmrt1基因cDNA序列的克隆及分析 Dmrt1基因是参与生物发育基因家族——Dmrt(Double-sex and Mab-3related transcription factor)家族的重要成员，是第一个在人类中克隆得到的包含DM结构域的基因。由于该基因参与脊椎动物性腺发育而引起人们的广泛关注(Raymond et al.,1998)，该基因的缺失可能引起雄性不育或性逆转(Raymond etal.,1999a;Raymond et al.,1999b;Calvari et al.,2000;Ottolenghi et al.,2000)。家鼠，红耳龟，密西西比鳄，红鳟鱼，粗皮蛙等物种的Dmrt1基因表达研究显示，在生殖嵴分化时期，正在分化的精巢中表达量远高于卵巢中的表达量(Raymond et al.,1999a;Raymond et al.,1999b;Kettlewell et al.,2000;Torres etal.,2002;Smith et al.,1999;Marchand et al.,2000;Shibata et al.,2002)。有趣的是，青锵鱼Dmrt1在成熟个体的精巢、卵巢和脾中都有表达(Ohmuro-Matsuyamaet al.,2003)。两栖类在进化中是从水生到陆生的过渡类型，具有特化的形态特征和功能，以适应不同的生活环境(费梁,1999)。两栖类的染色体组型呈现多样性，有的是XX/XY型，有的是ZZ/ZW型，有的是OW雌性/OO雄性，还有的是XX/XY和ZZ/ZW同种共存(Schmid et al.,2001)。其性别决定和分化的机制很复杂，既不同于哺乳类和鸟类典型的基因型性别决定(GSD, genetic sex determination)，也不同于爬行类环境型性别决定(ESD, environmental sex determination)。环境因素、遗传因素(包括性染色体和性别决定相关基因)、还有类固醇等性激素都影响两栖动物性别决定与分化(周林燕等,2004;黄敏毅等,2004)。黑斑蛙(Rananigromaculata)俗称青蛙，隶属两栖纲(Amphbia)，无尾目(Anura)，蛙科(Ranidae)，是一广布种(陈壁辉,1991)。黑斑蛙的雌雄个体间没有发现异型染色体(陈壁辉,1991)。那么究竟该物种是怎样进行性别决定和分化的呢？作为性别决定候选基因，Dmrt1基因在该物种中参与性别决定与分化吗？如果该基因是黑斑蛙的性别决定基因，那么定位于该物种的哪条染色体上呢？它在黑斑蛙的性别决定分化中又扮演什么角色？为了解答这些问题，首先我们要获得黑斑蛙Dmrt1基因序列。本实验室季代丽等(2005)通过RT-PCR已经获得了黑斑蛙Dmrt1的DM结构域序列，并检测不同组织的Dmrt1 mRNA的表达量，显示出该基因在成体黑斑蛙的精巢组织中有特异表达。为了进一步探究黑斑蛙Dmrt1的功能，我们提取了黑斑蛙精巢组织的RNA，设计多对引物，采用RT-PCR和RACE(5’-RACE和3’-RACE)技术，首次获得了黑斑蛙Dmrt1基因的全长cDNA序列，以期为探究黑斑蛙性别决定分子机制提供分子资料。 实验设计 1.2主要试剂 RNA提取试剂盒(Trizol Reagent, Invitrogen)；cDNA文库构建试剂盒(SMARTTM cDNA Library Construction Kit,Clontech)；100bp梯度Marker购自V-gene；DL2000Marker是Takara公司产品；LA-Taq酶和去除RNA中的基因组DNA试剂盒购自Takara公司；DEPC(二乙基焦碳酸盐)。 1.3实验器材处理 所有玻璃器皿(包括匀浆器、量筒、广口瓶等)和金属器材(包括解剖盒、解剖剪、解剖刀、解剖针等器材)，经肥皂水浸泡刷洗，流水冲洗，蒸馏水洗涤，再经1‰DEPC溶液37℃浸泡过夜，高温高压灭菌后，200℃烘烤；Eppendorf管和枪头等耐高温高压的塑料制品，经蒸馏水洗涤后，用0.1‰DEPC溶液37℃浸泡过夜，再经高温高压灭菌，去除残留DEPC，70-80℃烘干；电泳槽等不能高温灭菌的塑料制品，经肥皂水浸泡刷洗，流水冲洗，蒸馏水洗涤，再经1‰DEPC溶液浸泡4小时以上，再用1‰DEPC处理的缓冲液TBE或TAE冲净，烘干。 1.4精巢组织总RNA的提取 按照Trizol Reagent的操作说明，取黑斑蛙雄性性成熟个体，活体解剖后，迅速分离精巢组织，置于DEPC处理过的、冰预冷的匀浆器中，用解剖剪充分剪碎，加RNA提取试剂1ml Trizol，迅速匀浆至匀质进行下列步骤。(操作过程必须带手套、口罩，以免RNase污染；提取中所用的器具和溶液都要保证无RNas