的克隆和序列分析.PDF

维普资讯 29一 珊究 中 动物检疫 2007年第24卷第4期 一 文章编号：1005—944X(2007)04—0029—03 猪链球菌谷氨酸脱氢酶基因 的克隆和序列分析 谭世君 汤 明。) 聂 奎 王楷鹿 ’) 杨泽林 。J 黄保续 1J 范伟兴 ’ (西南大学动物科技学院 重庆 400715) 摘要 ：对猪链球菌2型、7型、9型的标准菌株和 7株猪链球菌2型分离菌的谷氨酸脱氢酶 (GDH)基因进行 PCR扩增 ，经回收纯化后克隆到PMD18一T载体，筛选阳性克隆菌后测序并对其进行序列分析 结果．PCR扩增出 1300bp左右的片段，包括 GDH基 因的整个开放 阅读框 ，而测序结果表明．其序列与GenBank中的猪链球菌GDH 基因序列一致，进一步序列分析表明，GDH的核苷酸序列在相 同血清型之间同源性高达99％~X上 ．而在不同血清型 之间的同源型也达到 了96％以上，而其氨基酸序列同源性则都在99％~X上 ，且都具有GDH 1型家族的功能区域 说明猪链球菌GDH基因及其蛋白具有高度的保守性 ．为进一步研究与应用提供 了重要依据 关键词 ：猪链球菌．GDH基 因．序列分析 猪链球菌(Streptococcussuis)是 和它表达的蛋白具有免疫原性 同 平板上 的菌接种到 T0dd—Hewitt肉 一 种重要 的人畜共患病病原体 ．可 时．这个蛋白又能特异性地与猪链 汤．37~(2振荡培养过夜 ，取细菌培养 致猪患脑膜炎、关节炎 、败血症 、心 球菌 2型免疫猪 的抗血清反应 ．说 物 1．5ml于EP管中．12000r／min 内膜炎、浆膜炎、支气管肺炎等疾病 明它可以作为猪链球菌感染的诊断 离心 2min：沉淀用TE缓冲液 567 flj人类感染该菌 ．可致脑膜脑炎、 性抗原 本试验对猪链球菌不同血 l重悬 ，加 20％SDS30txl和 20 败血症 、心 内膜炎等 ，病死率极高 。 清型以及相同血清型的不同分离株 mg／ml蛋 白酶 K3l混匀 ，37℃水浴 根据猪链球菌荚膜多糖抗原的差 的GDH基 因进行克隆．测序及序 1h：加 5mol／LNaC1100 l充分混 异 ．可将猪链球菌分为 35个血清型 列分析 以使进一步弄清猪链球菌 匀，再加 CTAB／NaC1溶液 80 l混 f1—34型和 1／2型)。就世界范围来 GDH基 因的遗传变异性及其抗原 匀 ，65℃水浴 10rain：加等体积氯 说 ．猪链球菌2型是最流行 的一种 结构特点．为其进一步的功能研究 仿 ／异戊醇 (24：1)混匀 ．12000r／min 血清型 ．也是致病性最强的一种2【1。 和应用奠定基础。 离心 10min：吸上清 ．转移到新 EP 近年来 ．猪链球菌 2型在我国很多 1 材料与方法 管中．加等体积的酚／氯仿／异戊醇 省 区时有流行或暴发 ．对集约化养 1．1 菌株 猪链球菌 2型标准菌株 f25：24：1)混匀 ．12000r／min离心 l0 猪及从业人员造成重大伤亡 同时． $735、7型标准菌株 8704 、9型标准 min：上清转移到新 EP管 ．加 0．6体 致病性较强 的还有 1型 、7型和 9 菌 株 2083 系 加 拿 大 Marcelo 积的异丙醇 ．为使充分沉淀．12000 型等．但 目前还没有人感染的报道。 Gonschalk教授惠赠 猪链球菌2型 r／min离心 10min：弃上清 ．沉淀用 猪 链 球 菌 谷 氨 酸 脱 氢 酶 分 离 菌 株 CQ0501 、CQ0502 、 lml70％乙醇洗两次．弃上清 ．室温 fGDH)是 Okwumabua等于 2001年 CQ0506系重庆市动物卫生监督总 放置 ，使 乙醇挥发干净 ；用 1000 l 发现的一个新的毒力因子f3J．其氨基 站分离并保存。猪链球菌2型分离菌 ddH，O溶解沉淀 、一2Occ保存备用 。 酸序列与存在于