试验六真核细胞基因组提取.PPT

实验六 真核细胞基因组提取 一. 实验目的及背景 高等动物，高等植物的基因组相当宠大， 如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成，果蝇基因组有１．４×１０８个碱基对，水稻基因组有１．４×１０９个碱基对。真核细胞基因组中，约１万－１．５万个可表达的结构基因，其它大量存在的是调控序列和内含子序列。可以说某特定物种的基因组，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，因而对真核细胞基因组的结构，组成，以及表达调控的研究是至关重要的，而研究的起点就是要获得纯度高－－不含蛋白质、糖类、酚、氯仿等污染；得率好－－以便有足够量用于分析；基因组相对完整－－断裂的基因组以便用于以后ＰＣＲ分析，RFLP分析，基因文库的构建，基因探测等的研究。 真核细胞基因组在提取过程中一般有以下几步，首先是机械法破细胞抽提；然后去除蛋白质，糖类等细胞内杂质污染；最后纯化出ＤＮＡ，由于真核细胞基因组较大，在操作中应注意动作轻柔，且在低温下进行，以最大限度地减少机械和化学作用对ＤＮＡ的剪切，从而获得相对完整的ＤＮＡ。 二．实验试剂及材料 材料：幼嫩的植物材料0.５ｇ左右。 试剂：液氮 CTAB抽提缓冲液：2%CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化铵) ，1%β-巯基乙醇 1.4mol/LNacl, 20mmol/L,EDTA, 100mmol/L, Tris-Hcl,pH8.0 3M NaAC 50mM Tris-HCl pH8.0 20mM EDTA 氯仿：异戊醇（２４：１） 异丙醇 ７０％乙醇 ＴＥ buffer 三．实验方法 1．取0.5g植物材料，双蒸水洗净，并用滤纸吸干。 2．植物材料剪成１cm左右碎片，放入预冷的瓷研钵中。 3．加入液氮速冷，研磨成细粉（越细越好）。 4．在5ml离心管中加入抽提缓冲液2.5ml，６０℃保温1小时。 5. 15000rpm，离心10分钟。上清转入另一个新的离心管中。 6．加入等体积氯仿：异戊醇（24:1），混匀抽提至水乳胶融状。 7. 15000rpm，离心10分钟。 8．上清转入另一个新的离心管中。 9．加入2/3倍体积预冷异丙醇，－２０℃保温30min—1hr，缓缓混匀ＤＮＡ成絮状折出。 10．15000rpm，离心１0分钟，弃上清。 11．ＤＮＡ沉淀用 ７０％乙醇洗２次。 12．加入４００μl TE buffer溶解DNA。 四．结果分析 1. 为了获得较为完整的基因组ＤＮＡ在实验中应注意什么问题？ * * *