PCR原理及PCR-SSCP.docVIP

聚合酶链反应（PCR） Polymerase Chain Reaction PCR技术诞生于1985年，美国Cetus公司人类遗传室的Kary Mullis—PCR技术发明者，因此获1993年诺贝尔化学奖。 基本原理： 在反应温度为90-95℃时，DNA变性成为单链；反应温度降至45-65℃时，两种引物与两条单链DNA退火而配对结合；反应温度升至72℃左右时，在TaqDNA聚合酶作用下，引物以单链DNA为模板逐步延伸成新的单链。“ 变性——退火——延伸”这一循环完成后，DNA复制了一次，由一个DNA分子成为两个DNA分子。 PCR两个重要特性：①能合成DNA的特定序列；②特定序列的大量扩增 变性复性的过程： 2．PCR 反应组成： Temple DNA、Primer、 4(dNTPs、DNA Taq酶、PCR Buffer 引物：是指两段与待扩增靶DNA序列侧翼片段互补的寡核苷酸。 长度一般在20-30mer 设计引物的原则： 与引物结合的靶DNA序列片段必须是已知的， 尽可能选择碱基随机分布的序列， 尽量避免多聚嘌呤，多聚嘧啶或其他异常序列， 两引物中G+C碱基对的百分比（%GC）应尽量相似， 若待扩增片段GC含量已知，则引物的GC含量则应与其类似，G+C碱基对含量以40-60%为佳， 引物内部应避免具有二级结构，尤其是发夹结构， 两引物之间不应有互补序列，以免形成“引物二聚体”。 设计引物的软件：olig06、Primer3、Real Time荧光定量PCR仪有设计引物软件。 2）4×dNTPs：提供靶DNA序列扩增的原料。贮存液的pH应为7.0。 A．反应体系中，每种脱氧核苷三磷酸浓度以50-200μmol/L为宜，且dATP、dCTP、dGTP、dTTP浓度相同。 浓度过高，有可能造成非靶位置启动和延伸时核苷酸的错误掺入，当dNTP＞50mmol/L，会抑制Taq酶的活性； 浓度过低，＜10-15μmol/L，影响扩增产量。 B．4种dNTP浓度不一致，导致核苷酸的错误掺入，降低合成速度，过早终止反应。 3．DNA聚合酶： Taq DNA聚合酶，热稳定性好，从一种嗜热菌——水生栖热菌（Thermus aquatics）YT菌株中分离得到，在95℃的半寿期为40min，Taq DNA酶只有聚合酶的功能，没有3’ →5’外切核酸酶活性，所以反应中免不了有错配，错掺率约为2×10-4。 减少错掺率的措施：①增加模板分子，②减少循环次数(减低DNA合成的总量)。 4．缓冲液及其它成份： Mg2+：合适浓度，高于dNTP总浓度，0.5-2.5μmol/L较合适。 若dNTP为0.2mmol/L，则Mg2+1.5mmol/L较合适。 [Mg2+]过高，易生成非特异性扩增产物， [Mg2+]过低，使产量降低。 Mg2+有效浓度受酶螯合剂EDTA和高浓度带负电荷离子基因，如dNTP中磷酸根的影响。 5．循环参数： 1）变性温度：变温，短时 2）退火温度：温度较高，可提高引物与模板结合的特异性 3）延伸温度：1000bp，1分钟足矣。 100-300mer，可采用简便的变性，退火双温循环。 6．循环次数 一般25-40个cycle,太多，增加非特异性扩增，太少，会减少PCR产量。  PCR-SSCP 　单链构象多态性( single strand conformation polymmorphism , SSCP) 是在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，根据短的单链DNA 或RNA 分子碱基序列不同形成的不同构象(有的文献称其为二级结枸)；一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度改变, 形成多态性。 1、原理 PCR-SSCP是1989年日本关谷实验室结合PCR反应和单链DNA非变性聚丙烯胺电泳首先创立的，其基本原理是：在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基顺序决定，其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链因其顺序不同，甚至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率不同。PCR扩增产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺电泳，靶DNA中含单碱基置换，碱基插入或缺失等变化时，因迁移率变化出现泳动现象。 E47 SSCP（其中5、7、8、9为AB型，1、3、4为AA型，2和10为BB型） E47（从上到下，AB、AA和BB） 染色方法：EB染色、银染、放射自显影 优点：能检测长度相同的单碱基多态。 缺点：分析片段不能太长，100-300bp，检出效率99%，300-450，＜90%；＞450，建议不采用SSCP方法检测。 Dw基