第2章基因操作工具.pptVIP

基因工程;《基因工程》;第二章 基因操作的工具酶;1、限制性核酸内切酶的发现 2、限制性核酸内切酶的分类合命名 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、限制性核酸内切酶的消化反应;;限制—修饰的酶学假说;1、限制性核酸内切酶的发现 2、限制性核酸内切酶的分类合命名 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、限制性核酸内切酶的消化反应;限制性核酸内切酶的概念;限制性核酸内切酶的分类;限制性核酸内切酶的命名;1、限制性核酸内切酶的发现 2、限制性核酸内切酶的分类合命名 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、限制性核酸内切酶的消化反应;II型限制性核酸内切酶的3大特点;EcoR I 5’-G?AATTC-3’ 3’-CTTAA?G-5’ Pst I 5’-CTGCA?G-3’ 3’-G?ACGTC-5’ 产生粘性末端;与II型核酸内切酶有关的几个概念;粘性末端（sticky ends，cohensive ends）;CTGCA?G ;几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点; 经同尾酶消化的DNA末端连接示意图; 推测酶切割位点出现的频率对于推断DNA酶切片段大小很有用。假定4种核苷酸在DNA分子上出现的频率相同，那么靶序列为6个核苷酸的内切酶在每46（=4096）个核苷酸中酶切位点就有一次出现机会。据此推算，一条4900bp长的DNA中有12个6核苷酸识别序列的酶切位点（49000/4096）。但事实上并非真正如此，因为DNA分子中4种碱基的出现频率并不均等。;1、限制性核酸内切酶的发现 2、限制性核酸内切酶的分类合命名 3、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4、限制性核酸内切酶的消化反应; 一个酶单位（U）指：在理想的反应条件（适宜的缓冲液和反应温度，通常为37℃）下，50?L反应体系中完全降解1 ?g ? DNA所需要的酶量。 影响酶活性的因素很多，最重要的有： A。DNA的纯度和甲基化程度 B。甘油的含量（不超过5%） C。反应体系中的离子强度 D。反应体系的pH值 F。反应的温度条件 （通常为37℃ ）;酶 切 反 应 的 基 本 步 骤;第二章 基因操作的工具酶;1、DNA连接酶作用的特点 2、DNA连接酶的反应条件 3、DNA连接的策略;DNA连接酶的发现;DNA连接酶作用的特点;载体去磷防止自连的应用示例;1、DNA连接酶作用的机理 2、DNA连接酶的反应条件 3、DNA连接的策略;DNA连接反应的条件;1、DNA连接酶作用的机理 2、DNA连接酶的反应条件 3、DNA连接的策略;粘性末端DNA片段的连接;平末端DNA片段的末端加尾连接法;平末端DNA片段加接头连接法;第二章 基因操作的工具酶;1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶）; 大肠杆菌DNA聚合酶I （E。Coli DNA pol I）是Kornberg A. 1956年首先从大肠杆菌E。Coli 细胞中分离出来的。它是一种多功能性的酶，包括 3种不同的酶活力： 5′- 3′聚合酶活性 以双链DNA为模板，催化单核苷酸结合到引物的3′末端，并不断延伸。 5′- 3′外切酶活性 将双链DNA中游离的5′末端逐个切去。 3′ - 5′外切酶活性 将游离的双链或单链DNA的3′端降解。不过对于双链的降解可被5′-3′的多聚活性所抑制。; 大肠杆菌DNA聚合酶I 的三种用途 ; 大肠杆菌聚合酶I的应用示例;缺口转移 (Nick translation);1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶）; Klenow片段的主要用途;1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3、T4 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶）; T4DNA聚合酶的特点; T4DNA聚合酶的用途;1、大肠杆菌DNA聚合酶I 2、Klenow片段 3??T4 DNA聚合酶 4、逆转录酶（反转录酶）; 逆转录酶—Reverse transcriptase;第二章 基因操作的工具酶;1、末端转移酶（terminal transferase） 2、核酸酶SI（SI nuclease） 4、碱性磷酸化酶;末端转移酶的特性; Characters of the polymerase;平末端DNA片段的末端加尾连接法;1、末端转移酶（terminal transferase） 2、核酸酶SI（SI nuclease） 3、碱性磷酸化酶（Alkaline