突变型hGM—CSF在毕赤甲醇酵母中的分泌表达.PDFVIP

2002年 6月 重庆大学学报 (自然科学版) V0I．25 No．6 第25卷第6期 Journal of Chongqing University(Natural Science Edition) Jun．2002 文章编号：1000—582X(2o02)06—0094—04 突变型hGM—CSF在毕赤甲醇酵母中的分泌表达 杨 红 ，欧阳克清 ，郭芝刚 ，李新平 ，陈云 高 ，蔡 绍皙 (1．重庆大学生物工程学院分子生物学实验室，重庆 400044；2．四川成都荣高实业集团有限公司，成都 610000) 摘 要：l临床研究发现，与大肠杆菌体系生产的hGM—CSF相比，利用酵母表达系统生产的hGM— CSF，具有毒副作用小等优点。鉴于非糖基化的hGM—CSF生物活性比人体天然产生的糖基化GM—CSF 活『生更高，采用PCR定点突变的方法修改hGM—CSF基因中的糖基化位点，进而在毕赤酵母(Pichia pastoris)中实现该突变型基因的高效表达。实验结果表明，突变型基因的表达产物具有天然hGM—CSF 的活性。 关键词：突变型hGM—CSF；毕赤酵母；分泌表达 中图分类号：Q786 文献标识码：A 人粒细胞 一巨噬细胞集落刺激因子(Human 变型基因在毕赤酵母中表达的产物具有天然hGM— Granulocyte—Macmphage Colony Stimulating Factor，hGM CSF的活性。 — CSF)是由127个氨基酸组成的造血生长因子。hGM l材料和方法 — CSF主要生物学功能是刺激造血前体细胞的增殖、 分化和增强成熟效应细胞(主要是中性粒细胞、嗜酸性 1．1实验材料 细胞和单核／巨嗜细胞)。在临床上主要用于骨髓移 1)质粒和菌株。质粒pPIC9k，pPIC9K—GM，大肠 植、癌症、AIDS、白细胞减少等病症的辅助治疗-1 ]。 杆菌(E．coli)TOPIOF’菌株，毕赤酵母(Pichia pastoris) 但在治疗中还存在许多未尽人意之处，如比活性低，治 GS115，KMT1菌株，人胎肝cDNA文库均由胡应和博 疗时用量大，循环半衰期短等缺点。临床实验表明，酵 士惠赠。 母系统表达的hGM—CSF与大肠杆菌体系表达的hGM 2)培养基和培养条件。大肠杆菌用 LB培养基， — CSF相比，具有较小的毒性和副反应发生率¨。J。天 在37 cc培养。酵母在30 cc培养，完全培养基为YPD， 然hGM—CSF由于糖基化程度不同，分子量从 14．5～ 选择培养基为RDB，表达增殖培养基为BMGY，诱导 32 KD不等。根据相关文献报道，临床试验表明未糖 表达培养基为BMMY。按照Invitrogen公司操作手册配 基化的hGM—CSF的生物活性更高¨。J。由此，实验室 制。 首次利用引物导入点突变的方法，从eDNA文库中钓 3)酶与试剂。TaqDNA聚合酶、限制性内切酶、购 出该基因并突变了其中的2个O一糖基化位点，即把 自上海生工生物公司，一抗购自Sigma公司，其余试剂 9一SerlO—Thr变为9一Alal0一Ala J。并选择了毕 为国产分析纯。引物合成委托胡应和博士在美国 赤酵母宿主系统作为表达系统。毕赤酵母表达系统是 Hugene公司合成。 近年来应用较多的一种表达系统，它具有胞外分泌表 1．2 实验方法 达，外源基因多拷贝重复整合到酵母染色体上，表达稳 1)引物的设计与合成。参照发表的人 GM— 定，产量高，适合高密度发酵，下游纯化相对容易等优 CSFcDNA序列，合成了2段引物： 点 J。是一种良好的表达系统。本实验以野生型hGM primed 5’GCA