桦褐孔菌菌株遗传多样性ISSR研究.docVIP

桦褐孔菌菌株遗传多样性ISSR研究应用ISSR (inter-simple sequence repeat)分子标记技术对21株不同来源的桦褐孔菌(Inonotus obliquus)菌株进行DNA指纹图谱分析，结果表明：从60条引物中筛选出11条ISSR引物对桦褐孔菌基因组DNA进行了ISSR-PCR扩增，共扩增出DNA谱带183条，其中多态性谱带169条，多态位点百分率为 92.3％，遗传相似系数变化范围为0.605～0.880。在遗传相似系数为0.763时，可将21个桦褐孔菌菌株划为6大类群，菌株聚类结果与菌株的地理分布有关。 桦褐孔菌； ISSR； 遗传多样性 桦褐孔菌(Inonotus obliquus)属多孔菌科（Polyporaceae）、纤孔菌属（Inonotus）,是十分珍稀而又名贵的药用真菌［1］，以其菌核入药［2］。桦褐孔菌主要分布在东欧的俄罗斯、波兰等国家, 我国主要分布于大、小兴安岭和长白山地区，其野生资源已濒临灭绝［3］，人工栽培刚刚起步，很少能获得子实体，而桦褐孔菌育种研究目前尚属空白，从DNA分子水平上弄清不同地理来源菌株间的遗传关系对该菌的育种具有重要意义。 ISSR (inter-simple sequence repeat)是ZIETKIEWIEZ等在1994年提出的一种锚定SSR的方法［4］，可直接对基因组DNA进行分析，不受任何环境条件影响，操作简单，多态性高，重复性好，被看作是克服了RFLP和RAPD许多局限性的新标记［5］，该技术在灵芝（Ganoderma lucidum）［6］、茯苓（Poria cocos）［7］、毛木耳（Auricularia polytricha）［8］和蜜环菌（Armillaria mellea）［9］等药用真菌遗传多样性分析中已有应用，而利用分子标记对桦褐孔菌遗传差异的研究报道较少。笔者利用ISSR标记技术，分析了21株不同来源的桦褐孔菌菌株的遗传差异，旨在为桦褐孔菌的品种选育、资源保护和开发利用等工作提供参考。 1 材料与方法 1.1供试菌株 各菌株编号及来源见表1，其中芬兰菌株由北京林业大学戴玉成教授赠送，日本菌株由日本鸟取大学北本丰教授赠送，其它菌株由长白山生物资源与功能分子教育部重点实验室保藏。 1.2菌丝体培养 取活化的菌丝体，接种于斜面培养基中（ 20 g葡萄糖，2 g蛋白胨，2 g酵母膏，0.5 g硫酸镁， 0.5 g 磷酸二氢钾，15 g琼脂，加水至1000 mL，pH自然），25 ℃暗培养20 d，待菌丝满管后，收集菌丝，无菌水洗涤2次，用无菌滤纸汲干菌丝体表面的水分，-20 ℃保存备用。 1.3总DNA提取及检测 采用改良的CTAB法［10］提取基因组总DNA，0.7％琼脂糖凝胶电泳检测质量。 1.4PCR反应及电泳 引物参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的ISSR引物序列，由北京英骏生物工程有限公司合成。 PCR反应在MG96G型PCR仪上进行。PCR反应体系：模板DNA 10 ng/μL，dNTPs 100 μmol/L，引物25 μmol/L，Taq DNA聚合酶0.5 U，Mg2+ 1.4 mmol/L，10 × buffer 2.5 μL，用ddH2O补至总体积25 μL。扩增程序为： 94 ℃预变性5 min，30个循环：94 ℃变性1 min、45～51 ℃退火1 min（退火温度因不同引物而定）、72 ℃延伸1 min，最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用GelDoc-It型凝胶成像系统照相。 1.5数据分析 将ISSR图谱以TIFF文件格式保存，有ISSR谱带的计为1，无带计为0，构成ISSR表型矩阵，输入NTSYSpc2.0软件进行分析，计算遗传相似系数，以平均连锁法（UPGMA）进行聚类分析，获得树状聚类图。 2 结果与分析 2.1桦褐孔菌遗传多态性分析 实验以21个菌株对60条ISSR 引物进行了筛选，其中有11 条引物能扩增出清晰且具多态性的带谱， 引物序列见表2。11条ISSR引物对21个桦褐孔菌菌株共扩增出183条带（表2），其中多态性条带169条，多态位点百分率为 92.3％，每条引物扩增出12～20条谱带，DNA片段大小为100～2200 bp。图2为UBC842引物扩增21株桦褐孔菌菌株DNA的ISSR指纹图谱。 Fig.1 ISSR fingerprinting profiles of I. obliquus strains amplified with primer UBC842 2.2桦褐孔菌遗传相似系数分析 遗传相似矩阵分析表明，21个桦褐孔菌菌株的遗传相似系数