实时荧光定量TaqMan-MGB探针法检测杆菌样巴尔通体.PDF

微生物学通报 Feb. 20, 2015, 42(2): 427−435 Microbiology China © 2015 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.140477 生物实验室 实时荧光定量 TaqMan-MGB 探针法检测杆菌样巴尔通体 1∆* 1,2∆ 1 1 1* 栗冬梅 刘云彦 杜鹏程 宋秀平 刘起勇 (1. 中国疾病预防控制中心 传染病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室 北京 102206) (2. 山东大学 生命科学院 山东 济南 250100) 摘 要： 【目的】应用 TaqMan 探针实时荧光定量 PCR 技术建立特异性强、敏感性高和稳定性 好的快速杆菌样巴尔通体检测方法。【方法】应用生物信息学方法查找杆菌样巴尔通体特有基因， 从中筛选出一段特有的基因序列为模板设计探针和引物。通过比较 Ct 值和荧光强度确定扩增反 应的最佳退火温度、探针和引物浓度；将扩增产物连接到 pEASY-T 载体上制备标准品，绘制标 准曲线，分析扩增效率和线性关系；评估方法的特异性、敏感性及重复性。【结果】优化后退火 温度为60 °C ，探针和引物浓度均为200 nmol/L ，反应体系20 μL 。特异性实验显示只有杆菌样 巴尔通体扩增出荧光信号，其他种属细菌均未见荧光信号；标准曲线线性关系良好(R2=1) ，扩增 效率E=98.18%；最低检出限为每个PCR 反应 3 个拷贝；组内和组间的变异系数 CV 值分别为 0.21%–0.42%和 0.29%–0.59% ，在允许范围内。【结论】研究建立的实时荧光定量TaqMan-MGB 探针法特异性强、灵敏度高、稳定性好，可快速检测鉴定杆菌样巴尔通体，为这种巴尔通体所引 起的一系列疾病的早期快速诊断、监测和流行病学调查等研究提供有效手段。 关键词：杆菌样巴尔通体，卡瑞恩病，实时荧光定量PCR ，TaqMan 探针，生物信息学 Detection of Bartonella bacilliformis by real-time PCR with TaqMan-MGB probe LI Dong-Mei1∆* LIU Yun-Yan1,2∆ DU Peng-Cheng1 SONG Xiu-Ping1 LIU Qi-Yong1* (1. State Key Laboratory for Infectious Diseases Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China) (2. School of Life Sciences, Shandong University, Jinan, Shandong 250100, China) Abstract: [Objective] Bartonella bacilliformis is a fastidious haemotropic gram-negative bacterium, an etiological agent of a life-threatening illness, termed Carrio