家兔免疫血清球蛋白分离与纯度鉴定.pptVIP

家兔免疫血清 ??球蛋白分离与纯度鉴定 一、目的要求 1. 了解层析原理 2. 掌握醋酸纤维薄膜电泳技术 二、实验原理 层析技术是近代生物化学最常用的分离技术之一。它是利用混合物中各组分的理化性质(吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等)的差异，在两相运动中，不断地进行交换、分配、吸附及解吸附等过程，可将各组分间的微小差异经过相同的重复过程而达到分离。配合相应的光学、电学和电化学检测手段，可用于定性、定量和纯化某种物质，其纯度高达99%。层析法的特点是分离率、灵敏度(pg-fg级)、选择性均高的一种分离方法。尤其适合样品含量少，而杂质含量多的复杂生物样品的分析。 无论哪种层析均由固定相和流动相组成。固定相可以是固体也可以是液体，但这个液体必须附载在某个固体物质上，该物质称载体或担体(Support)。同样流动相可以是液体也可以是气体。 层析技术的分类 一、按层析原理分类 吸附层析(Absorption Chromatography) 固定相是固体吸附剂，利用各组分在吸附剂表面吸附能力的差别而进行分离。 分配层析(Partition Chromatography) 固定相为液体，利用各组分在两液相中分配系数的差别或溶解度不同使物质分离。 离子交换层析(Ion Exchanger Chromatography) 固定相为离子交换剂，利用各组分对离子交换剂的亲和力不同而进行分离。 凝胶层析(Gel Chromatography) 固定相为多孔凝胶，利用各组分在凝胶上受阻滞的程度不同而进行分离。 亲和层析(Affinity Chromatography) 根据生物特异性吸附进行分离，固定相只和一种待分离组分有高度特异性的亲和能力而结合，而与无结合能力的其他组分分离。 二、按操作方式不同分类 纸层析(Paper Chromatography) 以滤纸作为液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到组分分离目的。 薄层层析(Thin Layer Chromatography) 以一定颗粒度的不溶性物质，均匀涂铺在薄板上，点样后，用流动相展开，使组分达到分离。 柱层析(Column Chromatography) 将固定相装柱后，使样品沿一个方向移动，以达到分离目的。 层析中的常用术语 一、保留值(Retention Value) 保留值表示样品中各组分 在层析柱中停留时间的长短或 组分流出时所需流动相体积的 多少。它用来描述层析峰在层 析图上的位置(图3-1) 二、层析峰区域宽度(Peak Width) 有3种表示方法： 1、标准差 因分离过程中流出的曲线是正态分布曲线，两侧拐点之间的距离为2个标准差?。?的计算：流出峰到基线的距离为峰高的0.607倍，所以?点峰高0.607倍处为层析峰宽度的一半。?大，说明组分流出分散，层析峰宽度也大，是柱效不高的表现。反之，?小，表示组分在层析柱中集中，层析峰就窄，柱效也高。 2、半峰宽() =2.354? 3、峰宽(Wb) 是指通过层析峰两拐点作切线交于基线上的截距。Wb=4?。 三.分离度(Rs) 指相邻两峰的保留差值是两峰宽平均值的几倍(图3-2)。 若 Rs愈大，说明分离效果愈好。在实际分离过程中，各组分含量不同，因而峰面积和峰宽在绝大多数情况下是不一致的，故一般用垂直线法来计算。具体是连接两峰顶，再从两峰间的峰谷向基线作一垂线，此线和上述连线交于3处。从3到峰谷的距离为f，从3到基线距离为g (图3-3)。 四.分配系数 在层析分离过程中，物质既进入固定相，又进入流动相，此过程称分配过程。无论哪一种层析法，在一定条件下，物质在固定相和流动相达到平衡时，它在两相中平均浓度的比值称分配系数(K)。 分配系数是由溶质的性质(分子大小、电荷、分子量等)所决定的。不同的层析机制，其K值涵义不同。吸附层析中，K值表示吸附平衡常数；分配层析中，表示分配系数；离子交换层析中，表示交换常数；亲和层析中，表示亲和常数。K值大表示其溶质在固定相中浓度大，在洗脱过程中，溶质出现较晚。K值小表示其溶质在流动相中浓度大，故在洗脱液中出现较早。 若两组分在同一条件下具有相似的K值，则表明两组分层析峰重叠大，分离效果差。为达到分离目的，需重新选择实验条件，包括层析方式和流动相的改变。 五.柱效 无论哪一种层析过程都是