自体外周血造血干细胞直接在﹣80℃冻存的临床-第三军医大学学报.docVIP

﹣80℃冰箱冷冻保存恶性血液病患者自体外周血造血干细胞的临床应用 陈月宽, 谭成孝, 张绍基, 袁 钟 (贵州省遵义医学院附属医院输血科, 贵州 遵义 563003) 自体干细胞移植（autologous peripheral blood stem cell transplantation，APBSCT）是治愈某些恶性血液病的有效手段之一。采集的干细胞CD34＋细胞数是否达到最低阈值（CD34＋细胞达1×106～2×106/kg）[1]以上外，干细胞冻存方法直接影响造血干细胞存活率的高低，是APBSCT是否成功的关键技术。我科自2007年1月至2008年5月为7例APBSCT患者进行了12次自体干细胞采集，平均采集次数1.7次/例，每次采集干细胞均用造血干细胞低温保护剂保护并直接在﹣80℃ 冰箱冷冻保存，取得了很好的效果，现报告如下。 资料与方法 1.1 临床资料 7例患者进行APBSCT，男性5例，女性2例，年龄17~46岁，平均31.5岁。体质量45～72 kg，平均58.5 kg。其中急性淋巴细胞性白血病（ALL）1例，急性单核细胞性白血病2例，恶性淋巴瘤（Ⅲ~Ⅳ期）4例。干细胞采集前均做骨髓穿刺涂片镜检，证实白血病已缓解、淋巴瘤患者无肿瘤细胞浸润骨髓。 仪器与试剂 CS‐3000plus血细胞分离机、医用冷冻保存袋（Baxter公司），KJX型冰冻血浆解冻箱,GZR‐I型自动高频热合机（苏州生物仪器),- 80℃深低温冰箱（日本三洋),造血干细胞低温保护剂（成分：二甲基亚砜、右旋糖酐、白蛋白、营养素。上海三生生物技术有限公司),血液保存液‐I（四川省南格尔医学股份有限公司），Facscalibur型流式细胞仪,检测CD34＋细胞试剂盒(ProcoUNT progenitor cell enumeration,美国BD公司），SW‐CJ‐IFD净化工作台（苏州安泰空气技术有限公司）。 1.3 APBSC动员与APBSC采集 联合化疗加粒细胞集落刺激因子（G‐CSF）动员，白细胞（WBC）降至最低点后开始恢复时给G‐CSF（150 μg，皮下注射，每天1次，5~7d），当WBC≥5.0×109/L，血小板(PLT)≥50×109/L时，用血细胞分离机对患者行外周血干细胞采集。采血速度为55 ml/min，采用血液保存液（ACD-I）作为抗凝剂，抗凝剂与全血的比例为1︰11，每次分离处理全血量为10 000～12 000 ml，耗时3～4 h，采集完后检测CD34＋细胞数达阈值以上停止采集，采集次数一般1～3次，每次采集完后干细胞收集夹（SVCC）可得55 ml左右的干细胞浓缩液。 1.4 外周血干细胞冻存 从﹣20℃冰箱中取出造血干细胞低温保护剂，放入4℃冰箱中融化。在无菌环境下，把装有造血干细胞浓缩液的采集袋放入冰水浴中，用分浆器连接采集袋与保护剂袋，保护剂缓慢加入到干细胞浓缩液里，并不断摇晃采集袋，使干细胞浓缩液与低温保护剂充分混匀。干细胞低温保护剂与干细胞浓缩液按4︰1的比例混合，将混合液装入规格为100 ml 医用冷冻袋中，每袋装入量为50 ~70 ml，为防止冷冻袋在冻融过程中气体膨胀导致冷冻袋爆裂，用50 ml规格注射器将冷冻袋内的空气抽净，严密封口后将分装有干细胞的冷冻袋直接平放于–80℃冰箱中保存。并留取少许干细胞浓缩液作外周血单个核细胞(MNC)计数与CD34＋细胞检测，同时用台朌蓝拒染法[2]测定干细胞存活率。 1.5 外周血干细胞的复苏与回输 患者经临床预处理后行自体干细胞回输。回输前将冷冻袋从–80℃冰箱中取出，立即放入40℃水浴箱中快速复苏，并不断摇动冷冻袋，使其在1～2 min内完全溶解，将完全溶解的干细胞用输血器快速回输入患者体内，以防止时间过长导致二甲基亚砜对造血干细胞的损伤。回输前给患者注射抗组胺药物和地塞米松以预防过敏反应，回输时密切观察患者的生命体征，回输后立即将冷冻袋中剩余的干细胞残留液送检，作MNC计数、CD34＋细胞的检测与干细胞存活率测定。 结果 采集的自体干细胞冻存21～69 d 解冻复苏后回输，在回输过程中，3例发生呕吐，减慢输注速度后呕吐消失；1例干细胞解冻后，其中1袋干细胞在输注时部分干细胞在输血器内发生凝集，更换输血器后继续输注凝集现象消失。7例患者移植后造血功能均重建，其中中性粒细胞﹥0.5×109/L和 PLT ﹥20×109/L恢复的平均时间分别为10 d与15 d，6例患者康复出院，经6～12个月后随访持续完全缓解；1例淋巴瘤患者移植后3个月复发。 7例APBSCT患者所采集干细胞在冻存前与冻存后CD34+ 细胞、MNC计数、干细胞存活率结果见表1。  表1 外周血自体干细胞