试验六细菌的单染色和革兰氏染色.PPT

实验六 细菌的单染色和革兰氏染色 一、目的要求 学习对细菌的涂片、染色和无菌操作技术。 了解染色原理、学习并掌握单染色和革兰氏染色技术 。 二、实验原理 细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，染色后，菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。微生物学中常用的是单染色法和革兰氏染色法。 革兰氏染色：先将细菌用结晶紫初染，加碘液媒染后，用乙醇脱色，再用番红复染。 如果细菌不被脱色而保存原染料颜色者（紫色）为G+ 如果被脱色，而染上复染剂颜色者（红色）为G- 。 其机理主要是由于两类细菌的细胞壁成分和结构不同。 三、实验材料 菌种：B. sub （枯草杆菌） 、E. coli（大肠杆菌）、未知菌 试剂：革兰氏染色液(草酸铵结晶紫、碘液、95%乙醇、番红染色液）、生理盐水 其他：显微镜、载玻片、酒精灯、接种环、吸水纸、擦镜纸等 （二）革兰氏染色 1. 涂片、固定 2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1min，倾去染液，流水冲洗至无紫色。 3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1min，后水洗。 4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30s，后立即用流水冲洗。 5. 复染：滴加番红染色液，染1-2min，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果。 五、结果与思考题 1. 革兰氏染色过程中E.coli染成( )色，B.sub染成( )色，未知菌染成( )色，分别为革兰氏反应的( )菌、 ( )菌、 ( )菌 ？ 2. 涂片用的玻璃片为什么不得有油污？为什么涂片要求菌膜要均匀、薄？ 3. 革兰氏染色的关键是什么？ * * G+：细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。 G—：细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 四、实验步骤 （一）单染色法 涂片→干燥固定→染色→水洗→干燥→镜检（高倍镜、油镜） 注意：1. 涂片时，玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。 2. 水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。 注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。