生物大分子考试重点.docVIP

生物大分子重点 生物大分子制备过程 一般可分为五个阶段 （1）材料的选择和预处理 （2）细胞的破碎及固液的分离 （3）提取 （4）纯化（包括盐析、有机溶剂沉淀、有机溶剂抽提、层析、超离心、结晶） （5）浓缩、干燥及保存 SDS凝胶电泳的基本原理 聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide gel PAG）是由丙烯酰胺单体（acrylamide, Acr）聚合成长链并通过交联剂N、N′甲叉双丙烯酰胺（N、N′PAG，methylenebisacr-ylamide, Bis ）与长链末端游离的功能基在有催化剂和增速剂情况下反应聚合而成的具有三维网状结构凝胶。 解离剂： 十二烷基磺酸钠（SDS） 1） .阴离子表面活性剂：它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1:2比例结合。破坏蛋白质分子之间的氢键和疏水作用，破坏蛋白质分子的二级和三级结构，变成只含有一级结构的肽，并保持蛋白的溶解性。其分离作用只受多肽分子的大小影响，蛋白质在电场中的泳动距离只与分子量有关。 2）. SDS掩盖蛋白质本身所带电荷，使蛋白质能够根据本身分子长度的大小带有相应的负电荷。每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，因此在进行电泳时，SDS-蛋白复合物在PAGE中的迁移速率只取决于蛋白的分子量大小。 等点聚焦电泳的基本原理 将蛋白质放在由两性电解质形成的pH梯度中，可以依不同蛋白质的等电点不同，达到分离的目的。关键：建立稳定的PH梯度。 4. 迁移率： 带电粒子在单位电场强度下的迁移速度，可描述带电粒子在电场中移动速度， 球形粒子的电泳迁移率和其半径，所带电荷及溶液粘度有关： M = V/E = QE/6πηr/E = Q/6πηr 粒子的迁移率的大小取决于粒子的性质，粒子迁移率的差别决定其能否分离 。 聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液的组成 丙烯酰胺溶液、过硫酸铵（催化剂），TEMED（加速剂），SDS（解离剂）等。 影响粒子在电场中泳动速度的因素有哪些 电场强度 （2） 缓冲液PH值及离子强度 （3）缓冲液的粘度 （4）缓冲液与带电质点的相互作用 （5）电泳时的温度变化，电压不稳 （6）支持介质的选择 7. 金属螯合层析： Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等过渡金属离子，可与蛋白质表面的组氨酸(His)，半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)等以配位键的形式发生亲和结合。另外过渡金属离子可通过与亚胺二乙酸或三羟甲基乙二胺形成亚胺金属-蛋白螯合物而键和到固定相上，用做亲和吸附蛋白质的配基。这种利用金属离子为配基的亲和层析称为金属螯合层析(Metal chelate chromatography)。 8. 色素亲和层析： 三嗪类色素(trigaine dyes)是一类分子内含有三嗪环的合成活性染料，具有抑制酶活性的作用，因此又称为模拟色素(biomimetic dye)。三嗪色素类与脱氢酶、激酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶和糖解酶等具有很高的亲和结合能力，利用色素为配基的亲和层析法又称色素亲和层析(Dye-ligand affinity chromatography) ，用途非常广泛。 9. 免疫亲和层析： 抗体与抗原之间具有高度特异性结合能力，利用抗体作为配基的亲和层析称免疫亲和层析(Immunoaffinity chromatogphy)。该方法，特别是以单抗为配基的免疫亲和层析法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。常用的配基有重组蛋白A和重组蛋白G等。蛋白A比蛋白G专一，但蛋白G能结合更多不同源的IgG。 外水体积：存在于柱床体积内凝胶颗粒之外、颗粒之间的空隙所占有的那一部分水相体积或溶剂体积，称之为外水体积或外体积，以Vo(outer volume)表示，单位为m1 11. 间隔臂： 在亲和层析中，配基与载体结合时，尤其是小分子配基，载体的空间位阻会影响配基和亲和物的亲和吻合，往往产生所谓的无效吸附。解决这一问题的方法是在配基和载体之间引入适当长度的“间隔臂”。以增大配基与载体之间的距离，减少待纯化蛋白质与其相应配体结合时的空间位阻效应。 12. 疏水作用层析：疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography)是利用蛋白质在非变性状态下与非极性物质的非特异性亲和力来分离纯化蛋白质的一种层析技术。此法较适合分离盐析后或高盐洗脱下来的物质。疏水作用层析的优点是与蛋白质结合容量高(10-100mg/ml