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疾病诊断新方法;DNA为基础的疾病诊断新方法 飞速进展的原因;分子生物学新技术;; (1)基因检测必须要有针对目标----特定基因 (2)直接检测特定基因的突变----位点、性质 (3)基因示踪----连锁分析;受检材料的选择：DNA，RNA或蛋白质;RNA优于DNA，但更难于获得与操作 1、目的基因易于获得组织中表达 2、较大基因未知突变筛查 3、RT-PCR和DNA测序相结合可检出DNA水平的突变，而且能可靠地检测出hn-RNA加工过程的异常剪接。 RNA检测时要注意的一些问题：①避免mRNA的降解②目的基因的表达组织③许多突变导致mRNA不稳定，因此杂和个体的RT-PCR产物可能只显示正常等位基因 。; 蛋白质表达分析---检测特异蛋白质 免疫印迹（Western blot）免疫组织化学 免疫荧光技术; 免疫荧光技术 ;二、基因检测基本原理及常用技术;探针标记;;Nick Translation;随机引物标记探针;Southern Blot;DNA 样品;(3)Northern 印迹杂交;;;步骤：;PCR;PCR扩增;三、筛查致病基因突变;未知点突变检测 缺失（重复）检测 PCR----SSCP 1、多重PCR PCR----DGGE 2、MAPH PCR----DHPLC 3、MLPA 4. Sequencing 5. DNA 芯片技术 ;（1）PCR-SSCP;PCR-SSCP过程：;; ;（3）PCR-DGGE;泽吮忙津峙深缝山僻尘冈翌镊营萍栅组咯鸭咐麻玉君核伊野漫厦膀首抖监疾病诊断新方法-课件疾病诊断新方法-课件;睡弦西祁庆铂辫亩战讼抑揩澳胺考苟荫制仁确扼室秋帮维兑卿揩梧哪跃良疾病诊断新方法-课件疾病诊断新方法-课件;垂直DGGE结果;6%DGGE检测家系成员PAH基因外显子6的电泳图;(3)PCR-DHPLC;DNA部分变性条件下检测DNA变异的原理： 变异型和野生型DNA可形成同源和异源双链． 其在色谱柱上保留时间存在差异， 异源双链因存在错配区而更易变性，在色谱柱保留时间短于同源双链而先被洗脱下来， 从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线，据此可以分辨出变异型DNA.;在经历95 ℃变性再缓慢复性后,存在多态或突变位点的靶序列PCR 产物会杂交形成杂合双链( heteroduplex) 和纯合双链(homoduplex) 混合物 ;钡族簇苹恒哼了崭秀痔买谈墟做柬唁韩何也卓沃硼啊哗椰柞坝直腻漳琴咨疾病诊断新方法-课件疾病诊断新方法-课件; DHPLC的特点： 灵敏，准确； 分析速度快，单个样本的分析时间仅需几分钟； 容易实现自动化操作； 适用于较大样本中基因突变的筛查 检测变异的PCR产物长度范围最好在200～500 bp ;DHPLC可应用于：;（4）DNA测序;DNA自动测序;（5）DNA芯片技术;基因芯片;检测缺失和重复; ⑵多重可扩增探针杂交(MAPH);多重可扩增探针杂交 (multiplex amplifiabl probe hybridization ,MAPH)的原理; (3) 多重连接探针扩增（muotiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)的原理 MLPA是基于MAPH技术基础上发展起来的，是一种灵敏度很高的相对定量技术，利用简单的杂和（hybridization）、连接（ligation）及PCR扩增（PCR amplication）反应，在单一反应管内同时检测最多40个不同片断的拷贝数的变化。; MLPA的原理 ; MLPA和MAPH技术的应用: 遗传疾病基因缺失、重复(如SMA、DMD基因等)、基因甲基化检测(如Prader-Willi syndrome (PWS) and Angelman syndrome (AS))、 抑癌基因诊断(如Breast cancer、Lung cancer…等)及mRNA分析等。 如染色体数目异常(Trisomy13、18 21)、 至今已发展出的检测探针种类，已超过上百种。;;134患儿外显子51，52，53，54缺失，135为患者母亲，为外显子51，52，53，54缺失携带者，137为正常女性对照，140为正常男性对照。;四、检测特定序列变化----已知突变检测;(1)限制性酶切图谱分析法---检测已知突变; ;;例2 HbS;;;(