PCR测定技术要点课件.ppt

;PCR测定的技术要点白雪丽山东省立医院检验科;PCR测定的技术要点 PCR的定义 PCR的基本原理 PCR反应的基本成分及其对结果的影响 PCR反应的基本条件及其对结果的影响 PCR扩增产物的分析技术 PCR技术的应用及其优缺点 PCR假阳性与假阴性的预防对策 ;PCR简史;PCR的定义;PCR的基本原理;PCR的基本原理;PCR原理示意图;PCR反应的基本成分及其对结果的影响;PCR反应的基本成分及其对结果的影响; 缓冲液 10 mmol/l Tris.Cl 提供适合反应的PH值（PH 8.4） 50 mmol/l KCl 促进引物退火 10 μg/ml 明胶或血清白蛋白 为Taq酶的保护剂 ; 引物 引物大小 上下游引物均为人工合成20nt左右的寡核苷酸单链 引物浓度 一般在0.1~1μmol/l 浓度过高，非特异性增加 浓度过低，敏感性下降 引物特异性 引物特异性决定扩增的特异性，不应与非扩增区域有同源性 ; 脱氧核糖核苷三磷酸（dATP dTTP dGTP dCTP) 为DNA合成的基本原料，要求四种dNTP等浓度混合（50~200μmol/l） ; 模板 种类 DNA或RNA 浓度 102 copies/ml 纯度 标本需要纯化 ; TaqDNA聚合酶 一般30~100μl 反应体系中需加入1~2U 浓度过高，非特异性增加 浓度过低，产物量降低; Mg2+ 一般为1.5mmol/l,为Taq酶活性所必需的 浓度过高，非特异性增加 浓度过低，产物量降低 ;PCR反应条件及对结果的影响;PCR反应条件及对结果的影响;变性温度与时间 PCR反应中模板DNA的变性十分重要。只有模板DNA或PCR产物的双链完全解开，才能有效地和引物结合，而这种结合是PCR扩增的基础。变性温度越高、时间越长，变性就越充分。但温度过高、时间过长又会影响Taq酶活性。常选用的循环变性温度为94℃ 时间30S。 在PCR反应开始阶段，反应体系中主要为原始模板，链较长，一般在进行PCR循环之前，先94 ℃预变性10min。;复性温度与时间 复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好，但容易出现错配，增加非特异性结合。温度太高不利于复性，大多数PCR反应的复性温度在55℃ 左右，时间30S。;延伸温度与时间 引物延伸温度一般为72 ℃ 。因为在这个温度下Taq酶有较高的活性，并且引物和模板的结合较为稳定。一般72 ℃延伸1min对于 1kb以内的扩增片段就已足够，如果扩增片段1kb，延伸时间可相应延长。;循环数 循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。 ;PCR;PCR扩增产物的分析技术;PCR扩增产物的分析技术;凝胶电泳分析技术;HCMV PCR产物电泳分析结果 ;探针杂交技术;探针杂交技术 膜上杂交技术 微孔板杂交技术 荧光探针标记技术 ;膜上杂交技术 通常采用尼龙膜或硝酸纤维素膜。基本操作是将待测核酸片段通过凝胶电泳分离后转印到膜上或直接点样于膜上再与探针进行杂交，然后经过漂洗、显色得到检测结果。（Southern 印迹、Northern印迹、斑点杂交） 可对产物进行定性分析，但对操作要求较高，一般只适用于科研工作。 ;膜上杂交技术检测结果;微孔板杂交技术 类似于ELISA技术中的双抗体夹心法。首先通过微孔板孔壁上包被的捕获探针来捕获PCR产物。然后再用带有标记的检测探针与产物另一区域杂交，经过漂洗显色即可判断结果。 可用酶标仪判读，用于半定量测定。但整个操作过程不是全封闭的，易造成扩增产物污染。;;荧光探针杂交技术 是近几年发展起来的一项新技术，我们通常所说的实时荧光定量PCR技术多采用的该项技术，该技术反应体系中除常规引物外，还引入了荧光基团标记的特异性探针，探针可与模板一对一结合。 包括： Taqman技术 Lightcycler技术 Molecular beacon 技术;Taqman技术原理;荧光探针杂交技术 优点： 在全封闭条件下进行PCR定量，有效防止了扩增产物的污染。 实时监测，荧光定量，结果直观，定量准确。 结合了PCR技术与探针杂交技术的优点，特异性强，灵敏度高。;PCR技术的应用;PCR的应用;PCR在病原体检测中 的优缺点;优点:;不足之处：;PCR假阳性和假阴性产生的原因和预防对策;假阳性产生的原因;假阳性的防范措施;尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法： 可防止以前扩增产物对下一次PCR反映的影响。是一个连续的防污染过程。每次实验都必须使用。一般对10