第八章 分子杂交技术.pptVIP

白瓷盘 玻璃板 滤纸 凝胶 尼龙膜 滤纸 吸水纸 玻璃板 重物 吸水纸转膜 优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱 （2）真空转移法 此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。 优点是快速,在30分钟内就能从正常厚度(4-5mm)和正常琼脂糖浓度(1%)的凝胶中定量地转移出来。转移后得到的杂交信号比Southern转移强2-3倍。 缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗膜不严格时,其背景比毛细转移要高。 （3）电转法 利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。 该法的优点是不需要脱嘌呤/水解作用,可直接转移较大的DNA片段。缺点是转移中电流较大,温度难以控制。通常只有当毛细管转移和真空转移无效时,才采用电泳转移。 （五）Southern杂交 1、预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位点 将固定于膜上的DNA片段与探针进行杂交之前，必须先进行一个预杂交的过程。因为能结合DNA片段的膜同样能够结合探针DNA，在进行杂交前，必须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭，这就是预杂交的目的。 预杂交是将转印后的滤膜置于一个浸泡在水浴摇床的封闭塑料袋中进行，袋中装有预杂交液，使预杂交液不断在膜上流动。 预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，但其中主要含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与DNA探针DNA杂交）、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点 2、杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA杂交 双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交 转印后的滤膜在预杂交液中温育4-6h，即可加入标记的探针DNA，即可进行杂交反应。 杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行。离子强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。 杂交过夜（至少18h），然后在较高温度下用盐溶液洗膜。 3、洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA 在洗膜过程中，要不断振荡，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，即停止洗膜。 洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水分，并用保鲜膜包裹。注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。 （六）杂交结果检测 1、放射自显影：适用于放射性核素标记的探针 （一）将滤膜正面向上，放入暗盒中。将2张X光底片放入曝光暗盒， （二）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。 （三）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片（洗片时先洗一张，若感光偏弱，则在多加两天曝光时间，再洗第二张片子）。 2、比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针 Southern杂交能否检出杂交信号取决于： 目的DNA在总DNA中所占的比例、 探针的大小和比活性、 转移到滤膜上的DNA量 探针与目的DNA间的配对情况等。 在最佳条件下,放射自显影曝光数天后, Southern杂交能很灵敏地检测出低于0.1pg与32 P标记的高比活性探针的(109 cpm/μg)互补DNA。如果将10μg基因组DNA转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测出哺乳动物基因组中1kb大小的单拷贝序列。 （七）Southern杂交在医学中的应用 1、酶切图谱分析 2、特定基因定性和定量 3、基因突变分析 4、限制性片段长度多态性的分析 二、Northern印迹杂交 原理：Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。 1、鉴别RNA 2、探针可用DNA或RNA片段 3、待测样品为总RNA或mRNA Northern印迹与Southern 印迹的不同点 1. 总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳； 2、变性：RNA电泳前加热变性，电泳在变性条件下进行,以去除RNA中的二级结构,保证RNA完全按分子大小分离。