第四章 基本常用技术.ppt

细胞冻存时，存在两种损伤：冰晶损伤 　　　　　　　　　　　　　溶质损伤 　 冰晶损伤：由于温度下降，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内、外结冰而致的细胞损伤被称为细胞的冰晶损伤。 冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。　　　 溶质损伤：因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤。 细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质的浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便发生渗漏。 溶质损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。 如果在溶液中加入冷冻保护剂时，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。 保护机理： 冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成 ； 通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。 影响冷冻效果的因素有以下几点： 　1.冷冻速率 　当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。 　当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。 2.冷冻保存温度： 液氮温度(-196℃)是目前最佳冷冻保存温度。 应用-70℃～-80℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。 4.冷冻保护剂（渗透性 非渗透性）： 渗透性常用甘油、DMSO 渗透到细胞内，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。 甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷。目前，DMSO的应用比甘油更为广泛。 非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。 大分子物质可以优先同溶液中水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。 二、使用逐级降温法进行冻存 1.主要材料 (1)仪器设备：普通冰箱、-30℃低温冰箱和-70～-80℃超低温冰箱、液氮冻存罐、离心机等。 (2)冻存管：容量为2ml。 (3)冷冻保护液：一般是以含20%小牛血清的细胞培养液与二甲基亚砜1份以9：1混合而成。现配现用，或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存。使用前，于室温下水浴融解。 (4)待冻存细胞。 2.细胞处理过程 (1)按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物,制备成单细胞悬液,计算细胞总数。 (2)将细胞悬液以800～1000r／min离心5min，弃上清液。 (3)向沉淀物中加入冷冻液。轻轻吹吸均匀，使细胞密度达1×106～1×107个/ml。 (4)按每管1～1.5ml的量，分装于冻存小管内。拧紧管盖。 (5)在冻存小管上做标记，包括细胞代号及冻存日期。 3.分级冷冻： （1）标准程序为-25℃以上时，下降-2～-1 ℃/min；-25℃以下时，下降-10～-5℃/min；温度达到-100 ℃时，可迅速放入液氮 （2）实际可采用普通冰箱冷藏层(4～8℃)，约40min；普通冰箱冷冻层(-10～-20℃)，30～60min；在-70～-80℃下过夜；最后将冻存小管投入液氮保存。 冻存的细胞存活率可达90%以上。 可使用细胞冻存盒进行一次性冷冻。 注意事项： 在使用DMSO前，不需要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。 在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制冷冻保护剂时最好带手套。 冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以避免液氮从液氮罐内溅出。 勿将冻存的细胞放置在0～-60℃这一温度范围内过长时间，低温损伤主要发生在这一温度范围内。 三、细胞复苏 1.主要材料 (1)仪器设备：恒温水浴箱、普通离心机。 (2)培养用液：完全培养液（20%血清+基础培养液） 2.复苏过程 (1)将恒温水浴箱的温度调至37～40℃。 (2)从液氮中取出冻存小管，立即投入37～40℃温水中快速晃动，直至冻存液完全融解。要在1～2min内完成复温。 (3)将细胞冻存悬液移入离心管。 (4)将细胞悬液经800～1000 r/min离心5min。弃上清液。 (5)给细胞沉淀物加入完全培养液，轻轻吹吸均匀。将细胞悬液移入培养瓶内，加