溶血素的制备.ppt

实验课要求 预习 不迟到、早退、不旷课、有事请假 穿白大褂、注意自我防护 不喧哗，不做与实验无关的事 不要急于开始做实验 不要急于写实验报告 实验完成后，自己把桌面收拾干净 值日要求：擦桌子，拖地、擦黑板、倒垃圾、关灯和门窗（劳动委员负责安排和监督） 认真完成实验报告 实验报告的要求 题目、原理、主要试剂与器材、步骤、结果（现象）、结论、注意事项、讨论（心得体会） 班级、姓名、学号 由学习委员统一收齐，按学号从小到大顺序放好，在下一周上课时交 自己写、书写整齐 订成一本或每次分开 免疫血清的制备 前言 将适当的免疫原性物质经过一定方式注入动物体内，一段时间后，动物血清中可出现特异性抗体，该过程称为免疫血清的制备，这种含抗体的血清称为免疫血清或抗血清。 制备高效价特异性免疫血清是免疫学基本技术之一。 免疫血清的质量受多种因素影响，如免疫原、动物的种类、接种途径和实验流程。 免疫血清制备的流程 1.免疫原的制备 --颗粒性免疫原的制备 绵羊红细胞、细菌 --可溶性免疫原的制备 蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、核酸 2.免疫动物的选择 （1）抗原与动物种属的关系：亲缘关系 （2）动物的个体状况：适龄、健康、体重 （3）抗原的性质：家兔对胰岛素不易产生抗体 （4）免疫血清用量和要求：大和小，R型和H型 3.免疫方法 （1）免疫原的剂量 免疫耐受 （2）免疫间隔时间 抗体产生的规律 （3）免疫途径 吸收和代谢速度 4.动物采血法 （1）颈动脉放血法 （2）静脉采血法 （3）心脏采血法 注：采血前，要预先测定抗体效价，若达到要求，应在末次免疫后一周及时采血，否则效价会下降。 5.免疫血清的纯化 去除非特异性抗体和其它血清成分 7.抗血清的鉴定 效价、特异性、纯度、亲和力 8.抗血清的保存 ①4℃保存：3个月或半年 ②冷冻保存：-20℃～-70℃、2～3年 ③真空干燥保存：4～5年 溶血素的制备 实验原理 将一定浓度的绵羊红细胞（SBRC）经一定的方式注入动物体内，一段时间后，动物血清中可出现特异性的抗绵羊红细胞抗体（溶血素），该过程称为溶血素的制备。 主要的实验试剂和器材 离心机 离心管（无菌、回收）、玻璃滴管（无菌、回收）、一次性注射器 生理盐水、酒精棉球 兔子、绵羊血 注：本次实验6人/组 实验步骤 制备免疫原 绵羊血3ml + 生理盐水3ml → 离心2000rpm×5min → 弃上清（用玻璃滴管吸，吸完后重新放回卷纸中） → 重复洗涤两次 →按压积用生理盐水配成10％SRBC悬液（注意无菌操作!） 免疫动物 时间安排 心脏采血 末次注射七天后采血。 将兔子仰卧位固定，用手摸出心跳最快的位点，用20ml的注射器刺入心脏，回抽注射器，看有无血抽出。若无血，则将注射器前进或后推一点，再回抽。将抽出的血液放入有玻璃珠的50ml离心管中，37℃水浴20～30min，离心2500rpm*10min，收集血清，放-20℃保存。 溶血素的鉴定 鉴定效价 实验方法：直接凝集实验 直 接 凝 集 实 验  --试管法 实验原理 在一定的电解质条件下，将已知的颗粒性抗原定量地与一系列倍比稀释的待测血清等量混合，静置一定的时间后，根据各管的凝集程度，判断待测血清的抗体效价。 此方法常用于抗体的半定量检测。 主要试剂与器材 待检血清 1％ SRBC 生理盐水 37℃水浴箱 加样枪 试管 实验步骤 结果观察和判断 先看对照管，轻摇动，应为不凝集，红细胞均匀的分散在液体中。 再看实验管，轻摇动，在稍微静置一会儿。 ++++ 液体澄清，全部的絮状碎片沉于管底 +++ 液体轻度混浊，绝大多数絮状碎片沉于管底 ++ 液体半混浊，约半数絮状碎片沉于管底 + 液体混浊，仅少数细小的絮状碎片沉于管底 - 表现与对照管相同 结果判断：能产生明显凝集现象(++）的最高血清稀释度为抗体（溶血素）效价。 结论 如：本次实验制备的溶血素效价为1:160。 注意事项 家兔性情温顺，不会咬人；但其容易受噪音影响，变得烦躁，所以在免疫动物时，安静有利于实验。 兔子受到惊吓或烦躁不安而难以固定，抚摸兔子背部的皮毛可以稳定其情绪。 制备免疫原和免疫动物时注意无菌操作。 心脏采血时，注射器不能刺入太深，也不能在心脏中左右滑动针头，否则心脏戳穿而难以抽血。 见书本P185，首次和第二次免疫接种的间隔时间更应注意，一般蛋白质抗原以间隔10-20天为好，颗粒型抗原可以缩短时间，采用快速免疫的方法。整个免疫