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第六章 DNA序列分析;人类基因组计划(human genome project, HGP);人类基因组计划(human genome project, HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。总体计划在15年内投入至少30亿美元进行人类全基因组的分析。 ;人类基因组;序列测定的技术 ;与 PCR反应类似。 反应体系中包含：模板 DNA, Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测序引物； 反应过程： 变性－复性－延伸－终止 ;Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）;*;炸凄乃绥扁氰杉献郴皮夺砧钠僚石杖偶苔隅愿蔚甩革镀丝逊莱拦俄冬敖丑DNA测序原理课件DNA测序原理课件;Sanger第一步：加入复制终止剂;ddNTPs参与下的DNA复制;Gel Electrophoresis DNA Fragment Size Determination;除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。;Maxam-Gilbert化学裂解法;碱基特异性化学切割反应： 硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。 肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。 在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。 ;G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。 G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。 T+C反应：肼（低盐） C反应：肼（高盐） 测定DNA长度~250bp。 ;化学裂解法测定DNA的核苷酸序列;墒郭爆庇拐塞秤桑屯宇甲官挛阿碑响么插净壤轧劣镜众贝陇欣钎杠谜储猫DNA测序原理课件DNA测序原理课件;DNA片断序列测定的策略;通用引物指导未知序列的测定;引物步移策略 将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。 克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。 但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。 定向缺失克隆策略、染色体步查法等。;鸟枪测序法(shotgun sequencing)：随机克隆测序 将待测的DNA片段随机打断并构建随机重叠克隆文库，然后通过通用引物测定每个克隆中的待测DNA序列。当这些已测序列的数量达到一定程度后，相当于待测DNA片断的每一部位的序列也就被测定出来了，通过这些所测序列之间的重叠部分，最终可将整个DNA片断的序列拼接出来，这样的测序策略称为随机克隆测序。   ;将DNA大片段切割成小片段的三种方法： 限制性内切酶酶切 超声波处理 DNA酶I降解(加Mn2+) ;鸟枪法测序的缺点;完整基因组的测序过程一般包括三个步骤： （1）建立克隆的物理图谱：如酵母人工染色体YAC（Yeast Artificial Chromosome）克隆、细菌人工染色体BAC（Bacterial Artificial Chromosome）克隆等； （2）利用鸟枪法（Shotgun Strategy）测定每个克隆的序列； （3）序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，如基因、调控元件、重复区域等，进而对序列的生物学特性进行注释。 ;DNA全序列;Map fragments;实验一目的基因、载体的制备;实验二重组子构建;实验三重组子转化;第四章作业： Southern 、Northern 、Western 杂交、生物芯片技术、RNAi技术原理分别是什么？ 第五章作业： PCR克隆与一般的DNA片段的克隆有何异同点？ 第六???作业： 1 Sanger双脱氧终止法化学降解法进行序列分析的原理是什么 ？ 第七章作业： 1 DNA诱变种类有哪些，各有何特点？