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实验六 水中大肠菌群(Coliform group)细菌的检测 实验目的 采用多管发酵法，以最近似数的方式测定水中大肠菌群2. 掌握微生物实验中无菌操作技术方法。 实验原理 如果水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原苗污染而引起肠道传染病。由于肠道病原菌在水中数量较少，故从水中特别是自来水中分离病原菌常常非常困难。大肠菌群细菌是肠道好氧菌中最普遍和数量最多的一类细菌，所以常常将其作为粪便污染的指示菌。即根据水中大肠菌群细菌的数目来判断水源是否受粪便所污染，并间接推测水源受肠道病原菌污染的可能性。一般规定每1000ml自来水中大肠菌群细菌不得超过3个． 50g样品，置于盛有450ml灭菌磷酸盐缓冲液并装有玻璃珠、石英砂的锥形瓶中，振荡l~2min，便成10-1稀释，以用于检验1.培养基； 1.1乳糖胆汁液体培养基：蛋白胨 20.0g， 1.6％溴甲酚紫醇溶液l ml， 乳糖5.0g， 胆酸钠5.0g 将蛋白胨、乳糖、胆盐加热溶解于1000m1蒸馏水中，调pH值至7.2～7.4，1.6％溴甲酚紫乙醇溶液l ml，充分混匀，分装于有倒置杜汉氏小管的试管中，注意小管中不得有气泡，115oC灭菌20min。 1.2伊红—美蓝琼脂(EM.B)培养基 a.蛋白胨琼脂培养基(其成分为蛋白胨10.0g；琼脂18.0g； pH值为7.6)1000mlb.20％乳糖2 ml ， c.2%伊红溶液2 ml， d.0.5％美蓝溶液1ml 将1000m1已灭菌的蛋白胨琼脂培养基加热溶化，冷却至60oC左右时，将已灭菌的乳糖溶液、伊红溶液及美蓝溶液按上述量以无菌操作加入，摇匀后即倒平板上。乳糖在高温灭菌易被破坏，故必须严格控制灭菌温度，一般为115oC，20min。 13亮绿乳糖胆汁(BG..B)液体培养基 蛋白胨10.0 g， 亮绿0.0133 g， 乳糖10.0 g， 胆酸钠0.0 g， 蒸馏水1000ml ， pH值 7.4分装试管后，加入杜汉氏小管，115oC灭菌20min。 2灭菌移液管、灭菌稀释水、试管、杜汉氏小管、革兰氏染液、灭菌培养皿。 1.假定试验 1-1.用10 ml水样，接种到二倍浓度的乳精胆汁臂中去，重复接种三支。 1-2.用l ml水样，接种到一倍浓度的乳精胆汁管中去，重复接种三支。 1-3.制备水样10-1和10-2的稀释液。 1-4.分别接种l ml10-1和10-2稀释液到一倍浓度的乳糖胆汁管中，每个稀释液接种三支。 1-5.在35oC 中培养48h，观察有无气体和酸产生。 1-6.在48h以内，培养管内倒置的杜汉氏管中有任何量的气体积累，便可断定为阳性假定试验若培养管内液体清晰而杜氏管中有气泡时，可能为放置不当而残存的空气泡，不可与产气的阳性反应相混同。无气泡者为阴性。产酸者呈黄色2.确信试验 oC培养48h。如在倒置的杜汉氏管中产气，不论其量多寡，皆为阳性确信试验。 2-2.凡初步发酵试验管在24h之前就显示活跃的发酵(产气量占杜汉氏管10％以上)的试管，应及时转移至确信试验的培养。 3完成试验 3-1.取上述阳性确信试验管，在伊红—美蓝平板上划线分离，为了确保获得分离的单菌落，须注意以下事项：a．划线间距至少相隔0.5cm；b．接种针尖端要稍弯曲；c．先对发酵管轻击，并使之倾斜，以免接种针挑取到任何膜状物或浮渣，d．划线时要用针尖的弯曲部分接触琼脂培养基平面，以免刮伤或戳破培养基。划线后培养皿倒置，于35oC 培养24h。 3-2.24h后，观察在EMB平板上出现的单个菌落，具核心及深绿色金属光泽者为较典型的大肠菌群菌落。尽可能挑取典型的或接近典型的大肠菌群菌落，在营养琼脂斜面上划线，置于37oC培养24h．挑取斜面培养物制成涂片，进行革兰 图1.大肠菌群细菌的检测 3-3.在EMB平板上呈较典型的大肠菌群细菌还可再次转接至乳糖胆汁发酵管中，在37oC下培养48h，产生气体者即确认了大肠菌群细菌的存在。 3-4.根据证实有大肠菌群细菌存在的阳性管数查表1-2，以确定大肠菌群数。整个试验的步骤见图1所示。结果及分析表2 最近似数(MPN指数和95%置信度检索出现阳性反应的试管数每100ml中的MPN指数 95%置信度 在3支10ml试管中 在3支1ml试管中 在3支0.1ml试管中 下 限 上 限 0 0 1 3 ＜0.5 9 0 1 0 3 ＜0.5 13 1 0 0 4 ＜0.5 20 1 0 1 7 1 21 1 1 0 7 1 23 1 1 1 11 3 36 1 2 0 11 3 36 2 0 0 9 1 36 2 0 1 14 3 37 2 1 0 15 3 44 2 1 1 20 7 89 2 2 0 21 4 47 2 2 1 2