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一种高效空气传播病毒采样器的开发 摘要：通过设计运行程序和采样装置，开发了一种便携高效的病毒采样器，运行程序采用单片机自动化控制，可实时显示采样速度、预置采样量和剩余采样量。采样装置采用鼓泡式吸附，并选用壳聚糖和DEAE阴离交换树脂作为吸附剂。另外，设计出操作方便快捷的采样筒装置，实现了吸附、洗脱一体化。查找出H1N1病毒和H5N1的保守序列并设计引物，对公交车、医院等人口密集的地方进行样品采集并采用荧光定量PCR检测。结果显示，病毒采样器结合荧光定量PCR能检测到的空气中最低H5N1和H1N1流感病毒浓度分别为46个/L和98个/L。 关键词：鼓泡式，壳聚糖，保守序列，荧光定量PCR 前言 病人是流感的主要传播源流感病毒主要潜伏在病人的鼻涕痰和唾液中流感病毒主要通过空气飞沫和接触传播流感病毒主要借助空气传播患者咳嗽打喷嚏甚至大声说话时都会将病毒扩散到周围的空气中随空气流动传播患者接触过的物体表面附着病毒再用手触摸鼻子眼睛嘴造成感染H1N1流感病毒（猪流感）、H5N1流感病毒、普通感冒病毒、SARS病毒、EB病毒（导致鼻咽癌）、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒等通过空气传播的与人类疾病密切相关的病毒达几十种之多[1,8,9]。 为能快速检验特定空间的空气质量，本项目开发出高效的流感病毒空气采样器，结合目前已经成熟的荧光定量PCR技术，可快速检、灵敏地检测出空气中可能存在的流感病毒。该装置主要由负压吸气装置、空气计量器、及病毒吸附液及吸附粒子组成。利用抽气装置，通过负压吸附空气，以每分钟恒定气流量，经过液体采集区，在溶液和溶液内的流感病毒特异性吸附粒子的吸附用下，使空气中的病毒粒子收集在小体积的液体中。然后通过过滤或离心，收集液体中的粒子，用市售的RNA萃取试剂盒萃取病毒mRNA，然后采用国家标准或公认的检测技术如荧光定量PCR检测病毒量[9,10,11]，病毒测定的拷贝数除以吸附的空气体积，即检测所得的单位空气中的病毒数。检测灵敏度可达到10~50个病毒/米3[4]。 壳聚糖是一种天然高分子聚合物，属于氨基多糖，学名为[（14）-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖]是至今为止唯一发现的带阳离子性质的碱性多糖DEAE-sepharose fast flow为市售弱阴离子交换树脂。 2.2 采集介质富集效果 将克隆有H5N1血细胞凝集素的质粒溶液喷雾到一较大密闭的容器中，同时用真空泵将容器中空气抽出分别经由等量0.05g/mL消泡剂、保护剂（BSA）、活性炭、乙二醇、壳聚糖、DEAE、壳聚糖/DEAE混合物组成的溶液和蒸馏水吸附后，离心收集并洗涤沉淀，所得沉淀物直接用Trizol试剂提取病毒总RNA，琼脂糖电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计定量，检验纯度。反转录按照反转录试剂盒步骤进行。Real-Time PCR所用引物为： H5N1上游引物序列：5’-ACATATGACTACCCACAGTATTCAG-3’ H5N1下游引物序列：5’- AGACCAGCTACCATGATTGC-3’ 以不吸附的病毒液PCR结果最为参考，并以一条模板作为一个病毒颗粒计，对比几种吸附剂的吸附效果，实验结果如图6： 图6 不同吸附剂对病毒颗粒的吸附效果 由图6可看出壳聚糖和DEAE对病毒颗粒的吸附效果较理想，而且由壳聚糖/DEAE组成的混合物吸附效果最好，与对照相比，吸附率为75%，由于喷雾和吸附过程中病毒颗粒损失较多，吸附剂对病毒的吸附率很难高于80%。故本实验选择壳聚糖/DEAE组成的混合物作为吸附介质。由于DEAE在鼓泡式吸附过程中会粘在采样筒壁上，因此采集介质以壳聚糖为主，DEAE为辅。当采集空气体积较大，时间较长时可只用壳聚糖作为采集介质。 3 定量PCR检测流感病毒 3.1 材料与方法 3.1.1 仪器与试剂 7300实施荧光定量PCR系统（Applied Biosystems），全自动凝胶成像分析系统，冷冻离心机，超净工作台，核酸电泳仪，紫外分光光度计（美国VARIAN公司），甲壳素，DEAE-sepharose fast flow，BioEasy SYBR Green I Real Time PCR Kit，RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit（Fermentas），Trizol，PET-H5N1质粒。 3.1.2 病毒总RNA提取，反转录PCR及Real-Time PCR 采样结束后，推动采样筒滤掉采集液，收集采集介质，蒸馏水洗涤3次，离心收集沉淀。用Trizol试剂提取病毒总RNA，琼脂糖电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计定量，检验纯度。反转录按照反转录试剂盒步骤进行。 Real-Time PCR所用引物： H1N1上游引物序列：5’-GCCAAAAGACCCAAAGTA-3’ H