人乳铁蛋白cDNA基因乳腺表达载体的构建与鉴定.PDF

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2011, February 25; 27(2): 253−261 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ ©2011 CJB, All rights reserved. 生物技术与方法 人乳铁蛋白cDNA 基因乳腺表达载体的构建与鉴定 1 1 1 1 1 1 1 1 1 孟立 ，张艳丽 ，许欣 ，王子玉 ，闫益波 ，庞训胜 ，钟部帅 ，黄荣 ，宋洋 ， 2 1 王金玉 ，王锋 1 南京农业大学动物胚胎工程技术中心，南京 210095 2 扬州大学动物科技学院，扬州 225009 摘 要: 为了构建人乳铁蛋白基因 (hLF) 的乳腺表达载体并验证其在乳腺细胞中的表达情况，本载体以山羊 β-casein 基因上游包括启动子、外显子 1、内含子 1、部分外显子2 作为 5′端调控序列，下游包括部分外显子 7 、内含子7 、外 显子 8、内含子8 、外显子9 及3′部分基因组片段作为3′端调控序列，长度分别为6.2 kb 和7.1 kb ，将hLF 基因 ( 目的 基因) 和Neo 基因 ( 筛选标记) 分别插入到5′端调控序列和3′端调控序列的下游，构建成pBC1-hLF-Neo 载体，其全长 为25.348 kb 。为了检测该载体的生物学功能，用脂质体介导法将其分别导入到山羊乳腺上皮细胞GMC 和小鼠乳腺癌 细胞株C127 中进行表达验证，经G418 抗性筛选8~10 d ，得到了药物抗性细胞克隆，经催乳素、胰岛素及氢化可的松 诱导培养，通过RT-PCR 、Western blotting 以及重组hLF 抑菌圈试验表明，山羊 β-casein 基因启动子驱动的hLF 基因能 够在C127 和GMC 乳腺上皮细胞中转录翻译，且重组hLF 具有抑制大肠杆菌生长的生物活性，这为下一步建立稳定整 合hLF 基因奶山羊胎儿成纤维细胞系奠定了基础。 关键词: hLF ，pBC1-hLF-Neo ，GMC 细胞，C127 细胞，生物学功能 Construction and identification of mammary expressional vector for cDNA of human lactoferrin 1 1 1 1 1 1 1 Li Meng , Yanli Zhang , Xin Xu , Ziyu Wang , Yibo Yan , Xunsheng Pang , Bushuai Zhong , 1 1 2 1 Rong Huang , Yang Song , Jinyu Wang , and Feng Wang 1 Center of Animal Embryo Engineering and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China 2 College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China Abstract: The aim of this study was to construct a mammary gland-specific