表达猪端粒酶反转录酶转座子载体的构建和其在猪细胞永生化中的应用.pdfVIP

何姗：表达猪端粒酶反转录酶转座子载体的构建及其在猪细胞永生化中的应用 表达猪端粒酶反转录酶转座子载体的构建及其 在猪细胞永生化中的应用 硕士研究生：何姗 导师：孙怀昌教授 摘要 细胞培养技术是细胞生物学研究、医学、病毒分离培养与疫苗研发等研究领域不可欠 缺的常用工具。细胞系具有一定的体外增殖能力，主要包括自发永生化细胞系和癌基因转 化细胞系，前者为正常细胞，但自然发生几率很低；后者的建立相对容易，但细胞的核型、 表型、分化等具有不同程度的改变，而且因含癌基因、抗性基因、病毒序列等安全隐患。 因此，建立不含癌基因、抗性基因和病毒序列的永生化细胞系具有很好的应用价值。 端粒(telomere)是真核细胞染色体末端的特殊结构，与细胞分裂和衰老密切相关。端 reverse 粒酶负责端粒的复制，由端粒RNA、端粒酶反转录酶(telomerase 与端粒酶相关蛋白组成。研究实验资料显示，导入外源TERT基因不仅可使原代细胞永生 化，而且建立的永生化细胞系为正常细胞。基因导入方法主要有重组载体转染法和病毒载 体转化法，前者基因转染效率较低，通常需用抗性筛选来获得稳定的细胞克隆：后者转导 效率较高，但存在病毒序列等安全隐患。转座子(transposon)是细胞基因组内可移动序列， 不仅可作为基因转移载体，而且基因转移效率较高，不需通过抗性筛选即可获得稳定表达 的细胞克隆。 本研究将转座子的基因转移高效性与TERT的细胞永生化相结合，先以猪蛋白翻译延伸 factor 因子la(elongation 经用绿色荧光蛋白报告基因细胞转染试验证明，猪源EF．1a启动子能在猪细胞中有效驱动目 的基因表达，其转录活性与人巨细胞病毒的强早期启动子相当；用重组转座子载体与转座 酶载体共转染猪成纤维细胞，反复传代后计数荧光阳性细胞克隆，结果显示SB转座子系统 能有效介导报告基因整合。 然后，用RT-PCR从猪源细胞克隆TERTcDNA，插入SB转座子载体，将重组载体 扬州大学硕士论文 pTEG．TERT与转座酶载体共转染猪肾原代成纤维细胞，培养后进行细胞克隆化，利用PCR 检测从10个细胞克隆中筛选到不含抗性基因等载体序列的细胞克隆，在体外己传50代以 上。细胞形态学观察结果显示，永生化细胞保持原代成纤维细胞的典型形态，并有相似的 生长曲线：与原代成纤维细胞相比，永生化细胞的倍增时间随传代次数增加呈变短趋势， 而克隆效率呈上升趋势；细胞周期检测结果显示，永生化细胞具有正常细胞的细胞周期， 但细胞增殖能力明显增强；细胞表面标志检测结果显示，永生化细胞具有成纤维细胞的典 型表面标志；细胞移植试验结果显示，永生化细胞在小鼠体内不具有肿瘤细胞的克隆形成 能力：病毒感染与检测试验结果显示，永生化细胞保持原代成纤维细胞对猪伪狂犬病等病 毒的易感性；支原体检测结果显示，永生化细胞系无支原体污染。这些研究结果表明，本 研究构建的表达猪TERT的转座子载体可用于猪细胞永生化研究，建立的猪成纤维细胞系可 用于猪病毒的分离培养和疫苗制备。 关键词：SB转座子系统；猪端粒酶逆转录酶：表达载体；猪肾成纤维细胞系 何姗：表达猜端粒酶反转录酶转座子载体的构建及其在猪细胞永生化巾的应用 3 PorcineTelomeraseReverse Constructionof VectorandIts inPorcine ExpressionTransposon Application CellImmortalization Abstract Cellculture isan researchtoolincell isolationand technologyimportant