细菌与真菌学实验.docVIP

细菌与真菌学实验 实验一 细菌形态结构观察 【目的】 1、了解细菌的基本形态和特殊结构观察法 2、明确细菌特殊结构在医疗实践中的意义 3、细菌不染色标本的观察方法 4、观察活细菌的形态及运动情况 【材料】 革兰染色标本片： 1、球菌：葡萄球菌、链球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌。 2、杆菌：伤寒沙门菌、大肠埃希菌、炭疽芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌。 3、螺形菌：霍乱弧菌或水弧菌。 细菌特殊结构标本片： 1、鞭毛:变形杆菌、 霍乱弧菌 2、荚膜:肺炎链球菌、 产气荚膜杆菌 3、芽孢：破伤风杆菌、 炭疽杆菌 细菌动力观察材料： 1、菌种：普通变形杆菌、表皮葡萄球菌。 2、变形杆菌和表皮葡萄球菌8～12min肉汤培养物。 3、其他：凹玻片、盖玻片、凡士林、牙签、接种环、酒精灯、香柏油、二甲苯、擦镜纸 一 细菌形态结果观察 1、使用油镜观察上述革兰染色标本片：认识细菌的三种基本形态。 注意观察各菌的形态、大小、排列方式及染色性等特点。 2、使用油镜观察细菌的特殊结构标本片： （1）荚膜：肺炎链球菌经革兰染色后，呈矛头状成双排列，菌体四周有不着色的透明圈（既荚膜）；肺炎链球菌与产气荚膜杆菌的荚膜（荚膜染色法），注意观察菌体及荚膜的颜色及两者的形态特点。 （2）鞭毛：变形杆菌与霍乱弧菌的鞭毛（鞭毛染色法），注意观察菌体和鞭毛的颜色、鞭毛的长短、数目及在菌体上的位置。 （3）芽胞：破伤风梭菌及炭疽杆菌芽胞（芽胞染色法），注意观察菌体、芽孢的形态、颜色及芽孢在菌体中的位置。 二、细菌不染色标本观察法（动力观察法） 1、悬滴法 图2－1－1 （1）取一张洁净盖玻片，用牙签涂少许 凡士林于盖玻片的四个角处。 （2）用接种环取3～4环普通变形杆菌或 表皮葡萄球菌液体培养物于盖玻片中央。 （3）把凹玻片凹面朝下盖在盖玻片上，使 凹窝中央正对菌液（见图2－1－1）。 （4）迅速翻转凹玻片，使粘附在凹玻片上 的盖玻片朝上。 （5）先用低倍镜观察，再换高倍镜观察。 图2－1－1悬滴法 普通变形杆菌有鞭毛，运动活泼，可向不同方向迅速运动。表皮葡萄球菌无鞭毛，不能作真正运动，只能在一定范围内作移位不大的颤动，这是受水分子撞击而呈分子运动（即布朗运动）。 2、压滴法 （1）用接种环取3～4环菌液于洁净载玻片中央。 （2）用小镊子挟一块盖玻片轻轻覆盖在载玻片的菌液上，放置盖玻片时，应将盖玻片的一端接触载玻片，然后缓慢放下，以免菌液中产生气泡。 （3）先用低倍镜对光找到细菌的位置，再换高倍镜观察细菌的运动。 【思考题】 1、在油镜下你看到了细菌有几种特殊机构？能否看到细菌菌毛？ 2、细菌特殊结构在医学上有何意义？ 3、细菌的动力检查有何意义？ 实验二 细菌涂片标本的制备及革兰染色法 【目的】1、掌握细菌涂片标本的制备和革兰染色法。 2、了解革兰染色法的意义。 【原理】 1、细胞壁结构学说：革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易渗入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇容易渗入。2、等电点学说：革兰阳性菌等电点（pH2～3）比革兰阴性菌等电点（pH4～5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负 电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易被95%乙醇脱色。 3、化学学说：革兰阳性菌菌体含有大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合成大分子复合物，使已经着色的细菌不被95%乙醇脱色；革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故容易被95%乙醇脱色。 【材料】 1、菌种：大肠埃希菌、葡萄球菌。 2、染液:革兰染色液一套：结晶紫染液、碘液、95%乙醇、稀释石炭酸复红染液。 3、玻片、生理盐水、酒精灯、吸水纸、接种环、玻璃蜡笔、香柏油等。 【方法】 一 细菌涂片制备 1、涂片：取一张洁净载玻片，用玻璃蜡笔在洁净载玻片上标记，于玻片两端各滴1滴生理盐水，不要太靠近玻片边沿。接种环在火焰上灭菌后，分别挑取少量葡萄球菌和大肠埃希菌于玻片两端的生理盐水中，并研磨成均匀混浊的菌液（如系液体标本，则不需加生理盐水，可直接涂于载玻片上），涂成约1cm×1cm大小的均匀薄膜，接种环灭菌后放回试管架上。 2、干燥：涂片最好在室温下自然干燥，如欲加速干燥，也可将涂膜背面置火焰上方不烤手的高处略加烘烤，但切勿紧靠火焰，以免将涂膜烤焦，细菌变形，染色后难以观察。 3、固定：涂片干燥后，手持玻片的一端，将载玻片的背面往返通过酒精灯火焰三次，共约2～3秒钟，注意温度不可太高，以玻片加温面触及皮肤感觉烫而尚能忍受为度。 固定的目的一是杀死细菌，二是使菌体与玻片粘附牢固，以免玻片上的细菌在染色过程中被水冲洗掉，三是固定后细菌蛋白质变性易被着色。 固定完毕，放置待冷后再进行染色。 注：无论何种染色，涂片均不可太厚，一定涂成薄膜；取第二个菌之前，一定要注意灭菌，否则两菌混淆；