5动物传代细胞培养与外源基因导入.docxVIP

实验五、动物传代细胞培养与外源基因导入引言：动物细胞原代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，会进一步扩展汇合，覆盖整个培养瓶底，细胞会因生存空间不足或密度过大，发生接触抑制，并引起营养物质枯竭和代谢产物积累，发生细胞中毒，影响正常生长。这时需要进行分离培养，细胞由原培养瓶按1：2或1：3稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。80%汇合或刚汇合细胞是理想的传代阶段。消化法细胞传代培养，是用一定含量的胰蛋白酶来进行消化，使贴壁的单层细胞脱离下来，形成分散的细胞悬液，然后用新鲜的培养液进行稀释、分装和培养。动物细胞原代培养成功，细胞生长增殖形成单层细胞后，会进一步扩展汇合，覆盖整个培养瓶底，细胞会因生存空间不足或密度过大，发生接触抑制，并引起营养物质枯竭和代谢产物积累，发生细胞中毒，影响正常生长。这时需要进行分离培养，细胞由原培养瓶按1：2或1：3稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代。80%汇合或刚汇合细胞是理想的传代阶段。消化法细胞传代培养，是用一定含量的胰蛋白酶来进行消化，使贴壁的单层细胞脱离下来，形成分散的细胞悬液，然后用新鲜的培养液进行稀释、分装和培养。1 .材料与方法1.1 材料人胚胎肾细胞株HEK293，真核表达质粒pCMV/β-gal。实验在北京市北京科技大学理化楼120进行。1.2 试剂DMEM培养基（胎牛血清、青/链霉素溶液）、胰蛋白酶溶液、PBS溶液、BBS溶液、CaCl2溶液、固定液、洗液1、洗液2、染液。PBS缓冲液NaCl 8.00g，Na2HP04 1.15g，KCl 0.20g，KH2P04 0.20g，pH调至7.2，超纯水定容到1000mL，分装，121 ℃灭菌20 min。BBS溶液（2×BES盐缓冲液）50mM BES（N，N-二[2-羟乙基]-2-氨基乙磺酸），280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4. 2H2O，pH6.96，121 ℃灭菌20 min。CaCl2溶液0.25M，121 ℃灭菌20 min。0.1 M铁氰化钾储液1.646g铁氰化钾加入50mlPBS溶液，121 ℃灭菌20 min。0.1 M亚铁氰化钾储液2.112g亚铁氰化加入50mlPBS溶液，121 ℃灭菌20 min。1 M七水硫酸镁储液12.323 g七水硫酸镁加入50ml去离子水，121 ℃灭菌20 min。固定液（无需灭菌）1×PBS（已灭菌），2％甲醛，0.2％戊二醛，2mM Mg2＋（高价阳离子需单独灭菌冷却后，使用前再与PBS溶液混和，以免出现沉淀。下同）洗液1（无需灭菌）1×PBS（已灭菌），2mM Mg2＋洗液2（无需灭菌）1×PBS（已灭菌），2mM Mg2＋，5mM 亚铁氰化钾，5mM 铁氰化钾100mg/mlX-gal储液用N，N-二甲基甲酰胺1ml溶解100mg X-gal，避光保存，无需灭菌染液（现用现制，无需灭菌）在洗液2中加入X-gal储液至终浓度0.2mg/ml1.3 方法1.3.1 HEK293细胞传代培养（第一天）从细胞培养箱中取出含HEK293细胞的培养瓶，倒置显微镜下观察。在超净工作台内打开培养瓶，吸去旧培养基，用1 mL PBS洗涤一次贴壁细胞。加入350 μl胰酶消化，覆盖瓶底。倒置显微镜观察，消化好后（细胞分散，不贴壁），立即加入3 mL培养基（培养基中的血清终止酶反应）。用移液枪悬吹培养液，成为单个细胞悬液。取1 mL细胞悬液，补4 mL培养基，传代培养。每组传代2瓶。放入CO2培养箱。培养条件为37℃，5% CO2。1.3.2 HEK293细胞铺板（第二天） 从细胞培养箱中取出含HEK293细胞的培养瓶，倒置显微镜下观察。在超净工作台内打开培养瓶，吸去旧培养基，用1 mL PBS洗涤一次贴壁细胞。加入350 μl胰酶消化，覆盖瓶底。倒置显微镜观察，消化好后（细胞分散，不贴壁），立即加入3 mL培养基（培养基中的血清终止酶反应）。用移液枪悬吹培养液，成为单个细胞悬液。向50mL离心管中加入23mL培养基。 将悬吹好的细胞液移至离心管中。离心管拧紧后，混匀铺板用。48孔板每孔加500uL细胞悬液。摇匀后，放入CO2培养箱，培养条件为37℃，5% CO2。1.3.3 磷酸钙共沉淀法转染表达质粒到HEK293细胞内（第三天）从细胞培养箱中取出含HEK293细胞的培养板，在超净工作台中换液，弃去原培养基，加不含抗生素的DMEM培养基每个孔500uL。把3μg真核表达质粒pCMV/β-gal加到500uL CaCl2，混匀。把DNA- CaCl2溶液加入500uLBBS溶液中，混匀，室温孵育10-20min。将DNA- CaCl2-BBS 混合物加入到48孔板内，每个孔20uL，轻轻晃动使溶液均匀。两个板一半加入DNA- CaCl2-BBS 混合物，另一半加入无质