测定酶活方法.doc

Antioxidant responses to drought in sunflower and sorghum seeding 方法 1测定土壤及植物水状况 （1）按照Barrs和Weatherley（1962）的方发测定叶片RWC（相对含水量）。在DAP（开花后的天数）分别为22，24，26和28时，每日10：00-11：00之间取样，每次取两片新近成熟的叶片→称重→将样品浸入蒸馏水中，在室温下浸润4h→在80℃下烘干48小时并在植物材料焦化前称重。（2）计算叶片的WC（自然含水量），其分母为叶片的鲜重。 （3）土壤WC的测定用传统的重量分析方法。在DAP为22，24，26和28时16：00从花盆的中心取样→称湿重→80℃下烘干48小时。 Notice 1RWC计算：RWC=（Wf－Wd）／（Wt－Wd）×100% 2WC计算：WC=（Wf－Wd）／Wf×100% Wf：d：叶片干重； Wt：叶片吸水饱和时的重量。 2酶粗提液的制备 为了测定CAT，POD和SOD，取叶片0.5g(f.wt)→于6ml，50mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0），冰浴研磨→匀浆用4层纱布过滤→以每分钟15000g，4℃，离心20min→取上清。上清液可用来测量酶活性（Zhang和Kirkham，1994）。 为了测定AP，DR，MR和GR，取叶片0.7g(f.wt)→于8ml，25mM冰冷的磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.8），冰浴研磨→过滤匀浆→以每分钟18000g，4℃，离心15min→取上清。上清液可用来测量酶活性（Cakmak，Strbac和Marschner，1993）。 试剂：磷酸钠缓冲液（含0.2mMEDTA，1%（w/v）聚吡咯烷酮，pH7.0）。 3酶活性的测定 所有的分光光度分析都使用Hitachi U-2000型分光光度计。 3.1SOD总活性的测定按照Giannopolitis和Ries（1977）的方法略作修改（Chowdhury和Choudhuri，1985；Zhang et al。，1995）。3ml反应混合液中含63μM的NTB，1.3μM的核黄素，13mM的蛋氨酸，0.1mM的EDTA，50mM的磷酸缓冲液（pH7.8）和20μL酶液。核黄素应最后添加。将盛有反应混合液的试管放置在两盏4000lux荧光灯下，打开荧光灯，反应开始，照光10min，关闭荧光灯，反应终止，马上测定它在560nm处的吸光度。不照光的反应体系在560nm处的吸光度作为对照，并将之从A560中减去。不加酶液的反应体系颜色最深，说明NTB被还原量最大。NTB的光还原量与SOD的活性呈反比。SOD酶活性采用抑制NBT光还原50%为一个酶活单位。 Notice：不加酶液的反应体系，以缓冲液代替酶液，其560nm处的吸光度作空白。 试剂：63μM的NTB，1.3μM的核黄素，13mM的蛋氨酸，0.1mM的EDTA，50mM的磷酸缓冲液（pH7.8） 试剂：NTB，核黄素，蛋氨酸，EDTA，磷酸缓冲液（pH7.8） 3.2CAT与愈创木酚POD活性按照Chance和Machly的方法测定（1955）。对CAT来说，其活性可以根据反应混合液1min内在240nm处的吸光度随着H2O2的分解而降低程度来确定（ε=39.4M－1cm－1，Chance和Machly，1955）。反应混合液包含50mM磷酸缓冲液（pH7.0），15mMH2O2，0.1ml酶液。加入酶液反应即开始。对POD来说，其活性可以通过测定反应混合液在460nm处的吸光度在1min内因愈创木酚的氧化作用而增加来确定（ε=26.6M－1cm－1，Chance和Machly，1955）。反应混合液包含20mM愈创木酚50μl，10mM磷酸缓冲（pH7.0）2.83ml，0.1ml酶液。加入40mMH2O220μl后反应开始。 试剂：H2O2，愈创木酚 3.3AP的活性可以根据反应混合液在290nm处的吸光度在1min内降低程度来确定（ε=2.8mM－1cm－1，Nakano和Aasda，1981）。反应混合液包含0.5mMAsA,0.1mMH2O2,0.1mMEDTA,50mM磷酸钠缓冲液（pH7.0），0.15ml酶液。加入H2O2后反应开始。该反应速率可以通过减去未加酶液反应体系的反应速率进行校正。 3.4GR活性可以通过检测反应混合液在340nm处的吸光度1min内因NADPH氧化而降低的程度来确定（ε=6.2mM－1cm－1，Cakmak et al.,1993）。反应混合液包含1mMEDTA，1mMGSSG，0.2mMNADPH，0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.8），0.15ml酶液。加入GS