第七章仪器分析法--高效液相色谱法.doc

第七章 仪器分析法--高效液相色谱法 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC) 第1节 概述 高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。 它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。 为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较： 1．高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cm·min-1. 例如:对氨基酸分离，用经典色谱法，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。 2．高效液相色谱法与气相色谱法 （l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物。 (2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。 (3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。 目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析生物学和医药上大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物。 高效液相色谱法的仪器设备费用昂贵，操作严格，这是它的主要缺点。 第2节 高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的结构 4个主要部分： 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 辅助装置：如梯度淋洗， 自动进样及数据处理等。 1．高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是核心部件。 高压输液泵特性 要求密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀。 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差，它们各有优缺点。 目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。 恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。 2．进样系统 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。 进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。 常用的进样方式 注射器进样： 针尖穿进有弹性隔膜的进样器，进入柱前的流动相中央 不能带压150×105 Pa进样，可以打开泄流阀后进样，然后关闭泄流阀恢复压力 停流进样方式难以取得精确的保留时间，峰形的重现性较差 2、高压定量进样阀 用于不停流不降压进样 定量准确，重现性好 常用的为六通进样阀 3 分离系统——色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。 一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm 以上。 前置柱 一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料（＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色谱柱内，经冲洗后，即可备用。 4．检测系统 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光检测器等。 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 紫外光度检测器（UV）：最小检测量10-9g·mL-1，对