具备实时动力学检测模式.pptVIP

Benefit of Mobility Shift LabChip Assays （1）直接检测酶促反应的底物和产物，灵敏度高，假阳性和假阴性率低 （2）可以覆盖几乎所有的药物筛选酶靶标 （3）具有实时动力学检测功能，提高了筛选实验开发和MOA研究的效率，节省了试剂 （4）不需要抗体或放射性试剂 （5）很高的检测精度，可以检测到其它技术没法检测的弱抑制剂 （6）简单快速的开发筛选实验 （7）适用于激酶实验中很宽的ATP浓度范围 （8）很小的反应体积（小体积微孔板，4－12ul体系） * * * Brij-35 0.015% (质量体积比)，一般买来的是30％的母液 (质量体积比) Mobility Shift Assays electrophoretically separate and measure both product and substrate resulting in minimal interference due to auto-fluorescing compounds. This results in very high quality assays with typical Z’ values of greater than 0.8. Caliper assays do not use radiometric labels nor do they require specific antibodies. * * 酶浓度滴定实验 在进行化合物筛选实验之前，一般需要先进行预实验以确定合适的酶浓度和底物的Km值。进行酶浓度滴定实验时，一般在384孔板上设定六个以上的酶浓度梯度，选择实时动力学检测模式，以一定时间间隔进行检测，最后根据检测数据作图，得到经过45－60分钟时间反应后可以使Conversion值达到30％的酶浓度 * 底物Km值的测定包括多肽底物和ATP两类。这里以ATP Km测定为例，在384孔板上设定10个ATP浓度梯度，两个重复，选择实时动力学检测模式，在120分钟内每5分钟检测一次，然后应用Michaelis Menton方程计算Km值。要完成该实验，如果利用EZ Reader平台，采用实时动力学检测模式，需要24个孔，而其它采用终点法检测的技术则需要576个孔，可见EZ Reade实时动力学检测的巨大优势。 * 反应线性测定 化合物筛选实验的敷育时间取决于在底物Km浓度和酶滴定实验测定的酶浓度下，反应进程维持线性的时间。在反应体系中，按上述要求加入底物和酶，运用实时动力学检测模式以一定时间间隔进行检测，图显示了利用EZ Reader平台测定鞘氨醇激酶1，2（Sphingosine1，2）的反应线性。 * 抑制剂IC50值的测定 * 实验的重复性或一直性进行评估。EZ Reader平台进行PKA（蛋白激酶A）筛选实验的重复性测试，分别检测了128个没有抑制剂（1ul DMSO）的反应和128个100％抑制的反应（终浓度3.2uM 星孢菌素（staurosporine））。结果显示了很好的一致性，Z’值达到0.94。 * 当找到具有抑制效用的化合物后，就需要进行MOA研究以描述抑制剂的作用机理和比较不同抑制剂的效用。 Once a compound has shown promising activity, follow up studies must be conducted to fully understand activity over time. The ability to follow reaction rates in real time greatly facilitates the determination of inhibition mechanisms and the calculation of dissociation constants (reversibility). * * Why do we want to profile the Kinome? Kinases are actually key components of the cell signaling networks. Protein Kinases are enzymes which catalyze the phosphorylation of proteins to turn them into an active or inactive form. Actually, a very large proportion of proteins in the cells are phosphorylated and a significant fraction