DCSIGN特异性适配子的筛选及鉴定.doc

　　DCSIGN特异性适配子的筛选及鉴定 ：陈芳, 曾洁, 孙平, 潘勤, 章晓联 【摘要】 　　目的: 筛选高特异性、 高亲合力结合DCSIGN的单链DNA适配子, 为开发抗HIV、 HCV和结核杆菌感染的新型预防和 治疗 试剂奠定基础。 方法: 采用基于细胞表面展示的SELEX技术（TECSSELEX）, 筛选出具有高亲合力结合DCSIGN的单链DNA（ssDNA）适配子; 运用流式细胞术（FCM）检测该适配子的亲合力; 对最高亲合力适配子库进行克隆和测序; ELISA和FCM方法检测单适配子ZD8与DCSIGN蛋白结合的剂量相关性; MTT法测定IC50观察适配子对细胞的毒性。 结果: 第14轮筛选的适配子库亲和力最高; DCSIGN抗体能抑制适配子结合表达DCSIGN蛋白的细胞; 第14轮库中筛选的单适配子ZD8 与DCSIGN蛋白的结合率呈剂量依赖性; 所筛选的单适配子对肝细胞几乎无毒性。结论: 成功筛选出DCSIGN蛋白的ssDNA适配子, 为防治HIV、 HCV和结核杆菌感染等DCSIGN相关性疾病, 提供新型预防和治疗的候选试剂和小分子药物。 　　AIM: To develop the high affinity DNA aptamers ployed to screen the DNA aptamers recognizing DCSIGN displayed on the surface of NIH3T3 cells. Some aptamers from the aptamer pools ers and target cells easured by floetry and ELISA. The values of IC50 ined to detect the toxicity of aptamers for cells by MTT method. RESULTS: The 14th aptamer pool had the highest affinity and the binding rates beter (ZD8) and DCSIGN protein anner. DCSIGN antibody can petitively inhibit the binding reactions beters and their target cells. The selected aptamers have very loers bound to DCSIGN protein ers）［2, 3］。TECSSELEX技术是将细胞作为筛选介质的SELEX筛选方法, 筛选中表面表达靶分子的细胞作为阳性正筛细胞, 没有表达靶分子的同系细胞作为阴性反筛细胞［4］。我们将表达DCSIGN蛋白的NIH3T3DCSIGN细胞作为阳性正筛细胞, 运用SELEX技术对DCSIGN靶蛋白进行正向筛选, 并用不表达DCSIGN蛋白的NIH3T3细胞进行反向筛选, 最终获得能结合DCSIGN靶蛋白, 同时可拮抗HIV、 HCV病毒颗粒结合DCSIGN蛋白的生物活性小分子核苷酸适配子, 以期开发预防和治疗感染性疾病的新型试剂。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 细胞、 细菌和质粒 NIH3T3细胞（不表达DCSIGN蛋白的阴性反筛细胞）, NIH3T3DCSIGN细胞(表达DCSIGN蛋白的阳性正筛细胞, 本实验室转染并鉴定)。大肠杆菌DH5α, pUC19质粒为本实验室保存; DMEM培养基以及RPMI培养基购自Gibco公司; DNA Taq polymerase和dNTP购自TaKaRa公司; DNA纯化试剂盒购于OMEGE公司、 T4 DNA连接酶和DNA marker为MBI公司产品; DCSIGN兔抗人多克隆IgG 购自Santa Cruz Biotechnology公司; HRP标记的羊抗兔IgG购自飞羿科技公司; FITC标记的引物和PE标记的羊抗兔IgG抗体购自Ebioscience 公司; HRPstreptavidin 购自ptglab公司; Gene Amp PCR System 2400 PCR仪(Foster city CA94404, USA), DMLA (CEM培养液（含100 mL/L胎牛血清, 1×105 U/L青霉素和0.1 g/L链霉素）于37℃、 50 mL/L CO2孵箱中培养; HepG2细胞用RPMI1640培养液培养。 　　1.2.2 DCSIGNGST蛋白的提取、 纯化和鉴定 将含有pGEXKGDCSIGN的菌种BL21于含有氨苄青霉素 (50 mg/L) 的LB培养基中37℃培养。培养到A