hTRsiRNA腺病毒的构建及其体外抗肿瘤的初步研究.doc

　　hTRsiRNA腺病毒的构建及其体外抗肿瘤的初步研究 ：李燕, 肖丽英, 姚刚, 李虹, 杨志伟, 李婉宜, 蒋忠华, 李明远 【摘要】 　　目的: 构建RNA干扰（RNAi）腺病毒, 通过体外实验观察其抑制肿瘤细胞中人端粒酶RNA（hTR）基因表达、 降低瘤细胞中的端粒酶活性、 以及促进肿瘤细胞凋亡等作用。方法: 首先用一种新的体外连接法构建腺病毒AdhTRsiRNA, 表达靶向hTR的小干扰RNA分子（siRNA）, 用100 MOI的重组腺病毒感染不同的肿瘤细胞系, 再用TRAPELISA法测定细胞端粒酶活性、 Realtime PCR测定hTR的mRNA水平、 流式细胞术(FCM)测定肿瘤细胞凋亡率及人端粒酶反转录酶（hTERT)的蛋白变化。结果: 感染了AdhTRsiRNA的肿瘤细胞的端粒酶活性明显降低, 其中以HeLa细胞降低最明显, 其端粒酶活性抑制率达到58.87%, hTR的mRNA表达下调70.21%, 细胞凋亡率为29.7%, 但hTERT的蛋白表达并不被阻断。结论: AdhTRsiRNA可以有效、 特异地抑制hTR基因表达, 诱导体外培养的肿瘤细胞凋亡, 具有抗肿瘤活性; 此结果提示AdhTRsiRNA在肿瘤基因 治疗 方面具有潜在的应用价值。 【关键词】 hTR 腺病毒 RNA干扰 端粒酶 抗肿瘤作用 　　Construction of adenovirus expressing siRNA against hTR and its antitumor activity in vitro 　　LI Yan, XIAO Liying, YAO Gang, LI Hong, YANG Zhient of Microbiology, edicine, Sichuan University, Chengdu 610041; Chengdu Institute of Biological Products, Chengdu 610063, China 　　[Abstract] AIM: To study the effect of the hTRsiRNA adenovirus on hTR mRNA gene silence, telomerase activity inhibition and antitumor in vitro. METHODS: RNAi adenovirus vector, AdhTRsiRNA, and negative control AdNTsiRNA proved ligation method. Different tumor cells and liver cell line, HL7702, e PCR and FCM erase activity, hTR mRNA, apoptosis rate and hTERT protein expression. RESULTS: As pared RNA levels (70.21%) and telomerase activity (58.87%) of HeLa cells significantly, increased apoptosis rate (29.7%). But the telomerase activity of HL7702 and hTERT protein didnt shoor cell gro could be a neethod for cancer gene therapy. 　　[Keyerase; antitumor 　　2006年的诺贝尔医学奖授给了发现RNA干扰（RNAinduced interference, RNAi）现象的 科学 家[1], 使目前广泛用于肿瘤和病毒所致疾病研究[2, 3]的RNAi技术更是锦上添花。为达到稳定、 高效的干扰效果, 目前科研人员都比较推崇用病毒载体介导的细胞内小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)表达技术[3]。端粒酶是维持肿瘤细胞永生化的重要分子基础, 通过抑制端粒酶活性来达到治疗恶性肿瘤的目的已成为肿瘤基因治疗的热点。人端粒酶有2个重要组成部分, 人端粒酶RNA（human telomerase RNA, hTR）和人端粒酶反转录酶(humantelomerase reverse transcriptase, hTERT)。hTR提供合成端粒DNA的模板, 其中5′CUAACCCUAAC3′部分的作用更为关键[4]。本课题运用一种新的腺病毒载体构建方法, 构建能表达针对hTR的模板部分基因的 siRNA 的腺病毒, 并通过体外实验观察其抑制