hUNC93B1基因的克隆、表达纯化及抗体制备.doc

　　hUNC93B1基因的克隆、表达纯化及抗体制备 　　【Abstract】AIM: To construct the prokaryotic expression vector containing hUNC93B1 gene, then induce the expression of this gene and purify the fusion protein, and at last using target protein to make the specific and high titer antibody. METHODS: The specific primers of hUNC93 gene plified by PCR. The PCR product n by virtue of its (His)6 tag. Rabbits muned munological adjuvant for specific antibody preparation. RESULTS: An 1808bp length fragment plified by PCR. The sequence atched in 1∶64 000 akes it possible to do further investigation on the relationship betUnc93b，鸡的cUnc93b，线虫的unc93和果蝇的AF145657等具有很高的同源性. 线虫的unc93基因对肌肉的收缩和及其共济运动具有重要的作用，当unc93基因发生等位基因的突变时，线虫将发生运动迟缓，并伴发运动的共济失调现象［2］. 为研究hUNC93B1基因与人心血管疾病之间的具体机制，我们设计了针对人hUNC93B1的特异性引物，通过PCR的方法扩增得到该基因片段，测序全部正确后亚克隆入原核表达载体，构建了hUNC93B1pRSETA载体. 转化入大肠杆菌BL21中，诱导表达并纯化出该蛋白. 用表达的蛋白免疫家兔，以获得了特异性和效价都相对较高的多克隆抗血清. 　　1材料和方法 　　1.1材料质粒pRSETA ，感受态细胞 BL21和XL10由本校生化教研室提供，PCR引物由北京赛百盛公司合成；人脑cDNA组文库购自Clontech公司，质粒提取和PCR产物胶回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司；Taq DNA 聚合酶，PCR marker，T4 DNA 连接酶，pMD18T 载体，SacI, HindIII及IPTG均购自大连宝信生物公司. 金属螯合亲和层析中所用Ni2+NTA琼脂糖介质购自Qiagen公司；HRP标记的羊抗兔二抗购自Santa Cruz Biotechnology；_030930)，利用Primer Premier 5.0软件，在其编码区的两端设计一对引物，序列：Up为5′GC GAGCTC ATG GAG GCG GAG CCG CCG CTC3′；Loin,加入1 U Taq DNA聚合酶，在PE2400 PCR 循环仪中反应， 用12 g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物. 　　1.2.3DNA序列测定和载体构建PCR 扩增产物用安徽优晶生物工程公司胶回收试剂盒回收，将回收的目的片段克隆到测序载体pMD18T中，送上海基康公司进行DNA测序. 序列测定所用的引物分别是M13r(-48)和 M13f (-47). 由于目的片段过长，另送一对针对该基因的测序引物，5′CTTCCTGGCCATGCTGCTGGTGC3′和5′GCACCAGCAGCATGGCCAGGAAG3′. 用SacI/HindIII双酶切将测序全部正确的hUNC93B1片段从测序载体pMD18T中切下，插入pRSETA表达载体中，构建重组原核表达载 hUNC93B1pRSETA. 　　1.2.4融合蛋白表达和纯化将重组质粒hUNC93B1pRSETA转化入BL21感受态细胞中，挑选阳性克隆，在LB培养基中（0.1 g/L氨苄青霉素）培养过夜，取50 μL菌液转接5 mL含氨苄青霉素的LB中，培养大约3 h后，待A600 nm值达0.4~0.5 时加入IPTG至终浓度为1 mmol/L诱导表达，继续培养5 h后，收取菌体（-70℃冻存）. 加入裂解缓冲液（NaH2PO4 50 mmol/L, NaCl 300 mmol/L, 1 mmol/L PMSF, pH 8.0）,超声裂菌（输出频率为65 Hz, 4℃, 6次，每次10 s）, 离心（12 000 r/min, 4℃, 50 min）. 分别取适量上清和沉淀进行SDSPAGE，分析目的蛋白的分布情况. 用金属螯合亲和层析法纯化目的蛋