TGFβ1、TGFβR1、Smad4在乳腺癌发生、发展中的作用及其相互关系.doc

　　TGFβ1、TGFβR1、Smad4在乳腺癌发生、发展中的作用及其相互关系 ：夏立平，刘晓力，陈国平，郑武平，何冬雷，高炳玉 【摘要】 　　目的：探讨TGFβ1、TGFβR1及Smad4三者在乳腺癌中的表达与其发生、 发展 、转移等生物学行为以及预后的关系，为乳腺癌发病和 治疗 机制提供理论和实验依据。方法：提取30例乳腺癌临床标本（经液氮、研磨等处理）和MCF7、T47D、SKBR3三种乳腺癌细胞（取指数增长期细胞）总RNA，反转录cDNA第一链，克隆TGFβR1、Smad4基因片段，测定质粒浓度，制备标准样品，并作出标准曲线，探针法荧光定量PCR（FQPCR）检测TGFβR1和Smad4基因mRNA表达。结果：FQPCR检测发现恶性程度高的SKBR3细胞，其TGFβR1和Smad4的基因拷贝数明显低于恶性程度低的MCF7细胞（P均＜0.01），T47细胞两种基因拷贝数介于两者之间。结论：随着乳腺癌细胞病理类型恶性程度增加，TGFβR1和Smad4 mRNA表达逐步下降，表明TGFβ1和Smad4可能具有类似乳腺癌抑癌基因的作用。 【关键词】 转化生长因子β1; 转化生长因子β1受体; Smad4; 乳腺癌 　　［ABSTRACT］ Objective: To investigate the expression of TGFβ1, TGFβR1 and Amad4 proteins and the relationship to the initiation, progression, metaptosis and prognosis of breast cancer. Methods: The samples of 30 cases and 3 cell lines(MCF7,T47D,SKBR3) of breast cancer RNA ad4 genes cloning id easured, standard curve ade, and the expression of TGFβR1 and Smad4 mRNAs achine. Results: The gene copies of TGFβR1 and Smad4 in SKBR3 cells iddle. Conclusions: Our studies by FQPCR shoad4 mRNAs expression, the ad4 act possibly as the role of antioncogene in breast cancer. 　　［KEY CF7、T47D、SKBR3细胞为本实验室保存。正常对照：选取非乳腺癌患者正常乳腺组织手术切除标本10例作为对照。 　　1.1.2 质粒和细菌 　　pGEMTTGFβR1 、pGEMTSmad4质粒构建按照pGEMT 载体试剂盒（公司）的说明。大肠杆菌DH5α为本实验室保存。 　　1.1.3 引物和探针 　　以Genebank中Smad4 和TGFβR1基因 的mRNA序列作 参考 ，各设计一对引物和一条探针。⑴Smad4 上游引物(P1)：5′GTCGAAAACAACGCTATTGACT3′； 下游引物(P2)：5′CAGAGAATTGTCGCCGTACAT3′； 荧光探针：5′TCAGGACGCGATACCTCGGTATACC3′。 ⑵TGFβR1上游引物(P1)：5′GAACGACAACGATTCAACT3′； 下游引物（P2）：5′GCAACACGATCATGACTT3′； 荧光探针为5′TCTACGTAATAGCATGCGCCAAAT3′。 　　探针5′端标记的荧光报告基团均为FAM，3′端标记的荧光淬灭基团均为TAMRA。引物及探针均由英俊公司合成。 　　1.1.4 主要试剂 　　RPMI1640培养基（GIBCO BRL公司）；无支原体胎牛血清（杭州四季青公司）；HEPES粉（ASBC进口分装）；PBS缓冲液（NaCl 8.0g, Na2HPO4·12H2O 3.63g, KH2PO4 0.2g, pH7.4，自配）；胰蛋白酶（Sigma公司）；EDTA（公司）；TRIzol Reagent（Invitrogen公司）；DEPC（威佳公司）；氯仿（国产）；异丙醇（国产）；RT试剂盒（Fermentas公司）；Taq 酶（Progema公司）；DNA Marker（威佳公司）；Gel Estration Kit和小量质粒抽提试剂盒（QIAGEN公司）；PCR产物纯化试剂盒（博彩生物公司）。 　　1.1.5 仪器 　　二氧化碳孵箱（Hereaus B5060EK/C