凝胶法鲎试剂使用说明书.PDFVIP

凝胶法鲎试剂使用说明书 用途： 鲎试剂是鲎阿米巴细胞的抽提液，用于通过凝胶法进行定性检测内毒素。 概述： 鲎试验是一种最灵敏和专一的内毒素检查方法，它是革兰氏阴性细菌细胞壁的产物，通常称为热原。 鲎试验的原理是内毒素与LAL反应可形成易于分辨的凝胶。简单、经济的的鲎试验使得它已广泛应用 于半成品、原材料以及药品、医疗器械和生物制品等产品的检查。美国药典的细菌内毒素检查法和美 国FDA指南为有效验证鲎试验法代替兔热原法提供了标准方法。 凝胶法是一种简单、重现性好的检测方法，将等量的凝胶法试剂和检品混合并及时放在 37℃下保温 加热60分钟。阳性反应表明检品中的内毒素含量等于或超过试剂的标示灵敏度，用λ表示。 生物原理 代替兔热原法的可行方法的发展由 Hopkins 大学的研究者们发起。FrederickBang观察到细菌导致 美洲鲎血管内的血液凝结。在协作研究中，Levin 和 Bang 发现导致凝结现象的因素存在于鲎的阿米 巴细胞中或循环血液细胞中，热原（细菌内毒素）触发浊度和凝胶形成酶促反应。在阿米巴细胞的溶 解物中发现的丝氨酸酶由内毒素和二价阳离子激活后引起一系列酶促反应，这改变了大量的蛋白凝结 物，产生蛋白酶凝胶。 由于放射性药品需要一种合适的热原检测法使得 Cooper、Levin和 Wagner将这一新方法扩大应用到 药品中。1970 年的一个比较研究显示鲎试验法比兔法更灵敏，而且试剂活性（凝胶和不断增加的浊 度）与内毒素浓度相关联。鲎试剂的改善、标准方法的制定和自动系统的开发以及对鲎试剂的反应能 力的进一步理解使得鲎试剂立即被广泛应用到各种生物制品、非经肠道药品和医疗器械的检查中。 鲎试剂反应要求中性的 pH值并依赖于时间和内毒素浓度。鲎试验局限于使用检品的溶液或抽提液， 大多数的鲎试验干扰都可用简单稀释来克服。 美国FDA终产品检测指南： 美国食品与药品管理局在 1987年发布了一份准则，通知生产人用药品和生物制品、兽用药品和医疗 器械的厂商，FDA认为有必要验证鲎试验作为终产品的内毒素检测方法，那些遵照鲎试验准则的厂商 将被认为符合 CGMPs有关规定。非经肠道药品的通用内毒素限值是5个内毒素单位（EU）每公斤剂量， 但鞘内药品的限值是 0.2EU/Kg，医疗器械浸取液不得超过 0.5EU/ml；与脑脊髓接触的器械的限值为 0.06EU/ml。 预防 鲎试剂只用于体内诊断，不用于检测内毒素血症，使用时须小心因为其毒性仍不为人所知。 所有与样品接触的材料或检测材料必须是无热原的，玻璃器皿必须经有效除热原，例如 200℃干热 3 小时。标示已灭菌和处理过的塑料制品通常是无热原的，然而那些不能经高温灭菌的材料或销售时没 有无热原标签的材料应小心检测其是否含内毒素。 可提供的试剂 可提供5.2ml/vial50次管和1.2ml/vial10次管的冻干的鲎试剂，试剂含有缓冲的阿米巴细胞溶解 物并已用单价和二价阳离子加以稳定。 1.加0.1毫升的每个检测样品的稀释液到检测试管中，至少重复两管。 2.加 0.1毫升的复溶的鲎试剂到每个试管中，先加阴性对照，最后加最高内毒素浓度。接着用手 或低速旋涡混合检测试管以避免混合了人工制品。 3.将反应试管放在37℃的水浴或干浴中恒温 60±2分钟，鲎试剂与内毒素的反应时间很关键，如 果有很多样品待测，反应应以2-4分钟的间隔开始，以便在上述时间限制内读取每一个检测。 由于鲎试剂的反应对温度很灵敏，应小心监测恒温器。还有，凝胶形成反应是很脆弱的，如果 在保温期间受到干扰，凝胶会被改变。 B. 内毒素对照系列（阳性水对照） 1.如果显示与标准终点一致，不需要每次检测都要做内毒素标准系列，做第一套实验时应至少每 天做一次内毒素标准系列，如果鲎试剂有任何变化，应重新做一次。 2.应用库存的溶液制备一套新鲜稀释的 2倍稀释系列，包括试剂的标示灵敏度，将 0.1ml每个浓 度的内毒素加到10×75mm的反应试管中，至少重复两管检测，从阴性（水）对照开始。 3.加0.1ml的鲎试剂至每支反应试管中，先从阴性对照开始，并按要求混合。 4.将反应试管放在37℃下不受干扰保温一小时。 C. 检测对照 1.将0.1ml用于检测的LAL检查用水加入重复两管中。 2.阴性水（内毒素）对照：没有内毒素系列时，加0.1ml的2λ浓度的内毒素标准品。 3.阳性样品对照：加0.1ml（双份）的含2λ浓度内毒素的混合物到检品中，可根据有效条件进行 缓