乙型肝炎病毒相关性肾炎肾组织中HBx、 MHBst mRNA的表达及其意义.doc

　　乙型肝炎病毒相关性肾炎肾组织中HBx、 MHBst mRNA的表达及其意义 ：于艳, 张 静*, 王汉民, 陈 威,洪柳, 刘彦仿 刘宏宝 【摘要】 目的: 检测乙型肝炎病毒相关性肾炎（HBVGN）肾组织中乙型肝炎病毒X基因（HBx）及截短型乙型肝炎病毒表面抗原（MHBst）mRNA的表达, 探讨HBx、 MHBst在HBVGN发生中的意义。方法: 采用原位杂交的方法对40例HBVGN患者的肾组织进行HBx、 MHBst mRNA检测。结果: HBVGN患者肾组织中存在HBx、 MHBst mRNA, HBx、 MHBst mRNA主要分布于肾小管上皮细胞的胞质内, 少数肾小球上皮、 内皮、 系膜细胞的胞质内也有分布; 肾小管上皮细胞内HBx、 MHBst mRNA阳性率分别为82.5％（33/40）、 80％（32/40）, 肾小球内HBx、 MHBst mRNA阳性率分别为30％（12/40）、 22.5％（9/40）, HBx、 MHBst mRNA在肾小管上皮细胞的表达明显高于肾小球（P＜0.01）。结论: 在HBVGN肾组织, 特别是在肾小管上皮细胞的胞质存在HBx、 MHBst mRNA的表达, 提示HBV感染及其基因整合可能在HBVGN发生中有一定意义。 【关键词】 乙型肝炎病毒相关性肾炎; HBx; 截短型乙型肝炎病毒表面抗原; 原位杂交 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染在我国高发, 由其所引发的乙型肝炎病毒相关性肾炎（hepatitis B virus associated nephritis, HBVGN）较常见［1］, 但目前有关HBVGN的发病机制尚不十分清楚。既往研究发现肾小球内存在HBV的完整病毒颗粒（Dane颗粒）或类似病毒的颗粒［2］; 在肾小球内及肾皮质中检测出游离和整合的HBV DNA和mRNA, 提示HBV在HBVGN肾组织（以肾小管上皮细胞为主）内存在复制［3］, 对肾组织可能具有直接作用, 但在此方面尚未见到深入研究的报道。在肝脏研究中, 发现第194～76个氨基酸之间截短的乙型肝炎病毒表面抗原（Cterminally truncated middle size surface proteins, MHBst）和全长的X蛋白（hepatitis B virus X protein, HBx）基因编码的蛋白均具有反式激活作用, 能够激活某些核转录因子, 使其发生核转位, 导致炎症的发生［4］。为此, 我们运用原位杂交方法, 对40 例HBVGN患者的肾组织石蜡标本中HBx、 MHBst mRNA的表达进行检测, 观察HBV在肾组织中的存在及复制情况, 以期探讨HBV在HBVGN发病机制中的作用, 为临床HBVGN的诊断和 治疗 提供依据。 1 材料和方法 1.1 材料 HBVGN石蜡标本(40例)收集自1999-01/2005-10西京 医院 院收治的住院患者40（男34, 女6)例, 年龄14～68岁, 病程20 d～10年, 所有病例均经HBV血清学检测证实存在HBV感染, 并在B超引导下经皮肾穿刺活检术, 肾组织分别进行组织学、 免疫组化染色/免疫荧光及超微病理检查, 病理类型证实均为不典型的膜性肾病, 符合我国1990年制订的乙肝相关性肾炎的诊断标准［5］。设置2例血清HBsAg阳性的慢性活动性乙型肝炎患者肝组织为阳性对照; 阴性对照8例, 5例为原发性膜性肾病, 3例为肾小球轻微病变, 均经常规肾活检及电镜诊断证实, 并结合HBV血清学及肾组织内免疫组织化学检测HBVAg等检查排除HBV感染及其他继发性膜性肾病。Taq DNA聚合酶购自Promega公司; DNA回收试剂盒购自优晶生物工程公司; 检测试剂盒购自Roche公司。 1.2 方法 1.2.1 引物设计与合成 根据adr亚型HBV cDNA基因序列［gi:设计HBx、 MHBst DNA探针的PCR引物, 引物由上海生工生物工程公司合成。 1.2.2 PCR反应及产物纯化 10×Buffer 5 μL、 10 mmol/L dNTP 4 μL, 模板DNA 3 μL（除MHBst 2为1 L）, 特异引物各1 μL, Taq DNA聚合酶0.5 μL, 加ddH2O至50 μL, 反应参数为94℃预变性5 min, 然后94℃变性30 s, 54℃复性30 s（除MHBst 2为52℃）, 72℃延伸40 s, 循环30次（MHBst1、 2为35次）, 72℃再延伸7 min。PCR产物琼脂糖电泳, DNA回收试剂盒回收、 纯化DNA片段。 1.2.3 地高辛标记HBx、 MHBst DNA探针 采用DNA随机引物法进行标记,