人参皂苷Rg1激活PI3K-Akt信号通路对6OHDA毒性作用的影响.doc

　　人参皂苷Rg1激活PI3K/Akt信号通路对6OHDA毒性作用的影响 【关键词】 人参皂甙;羟多巴胺;毒性作用;蛋白激酶B;神经元 [ABSTRACT] Objective To study the signaling pathethod, and the cell survival observed by MTT method. Results 6OHDA inhibited the Akt phosphorylation in a timedependent manner in MES23.5 cells (F=24.51,Plt;0.01). Pretreatment ent ine; Toxic actions; Casein kinase B; Neurons 　　帕金森病(PD)是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，其主要的病理改变是中脑黑质致密带(SNzc)多巴胺(DA)能神经元功能障碍[1,2]。PD的病因迄今未明，发病机制十分复杂，研究认为可能与氧化应激、兴奋性毒素、线粒体功能障碍、细胞凋亡等机制密切相关。目前对PD的治疗手段不断发展，可分为药物治疗、基因治疗和外科治疗等，但药物治疗长期应用后的副作用、外科手术治疗的昂贵及远期疗效的不确定性，使得各国学者试图从不同的角度入手，探寻新的治疗方法。人参皂苷是人参的主要活性成分，包含有30多种人参单体，如Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc等，Rg1在人参皂苷中的含量丰富。近年来的研究显示，人参皂苷Rg1具有多种生物活性[3,4]，特别是在中枢神经系统，Rg1具有神经营养和神经保护作用。本研究室的前期实验已揭示Rg1可以对抗6OHDA对MES23.5神经元的损伤[5]，为了进一步探讨人参皂苷Rg1对抗6OHDA毒性作用的机制，本研究应用6OHDA损伤MES23.5神经细胞，建立PD细胞模型，并应用人参皂苷Rg1进行干预，从细胞和分子水平探讨6OHDA诱导神经毒性的信号途径以及Rg1的保护效应，以期为人参皂苷Rg1的神经保护作用机制提供进一步的实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 试剂及其 　　纯度为99.9%人参皂苷Rg1购自白求恩医科大学;DMEM/F12培养基购自Invitrogen公司(美国);6OHDA购自Sigma公司(美国);抗Akt抗体购自Santa Cruz公司(美国);抗磷酸化Akt抗体购自购自Cell signaling公司(美国);LY294002购自Tocrics公司(美国);ECL化学发光试剂盒购自Promega公司(美国);噻唑蓝(MTT)和胎牛血清均购自Gibco BRL公司。MES23.5细胞由乐卫东教授提供(美国贝勒医学院)。 　　1.2 细胞培养及药物处理 　　MES23.5细胞接种于96孔板或6孔板，用含体积分数0.05牛血清及Sato成分的DMEM/F12培养基，于37 ℃、体积分数0.05的CO2条件下培养。当细胞融合达80%～90%时，分别用在有或无LY294002 (10 μmol/L)存在的情况下，应用Rg1(10-8mol/L)预保护24 h,然后再给予6OHDA(100 μmol/L)，共分为对照组、6OHDA组、Rg1+6OHDA组及Rg1+LY294002+6OHDA组。 　　1.3 MTT法检测细胞生长 　　将传代细胞接种于96孔板中，每孔细胞数量为3×103个。当细胞均匀贴壁生长时，在有或者无LY294002共存情况下，先用10-8mol/L的Rg1预保护细胞24 h，再用6OHDA处理，24 h后去除培养液，加5 g/L的MTT 20 μL，于37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱继续培养4 h，每孔中加DMSO 100 μL，混匀后用酶标仪检测波长570 nm处的吸光度(A)值。计算细胞存活率。 　　1.4 免疫印迹法检测pAkt和Akt蛋白的表达 　　将传代细胞接种于6孔板中，6OHDA组用6OHDA(100 μmol/L)处理细胞0.5、1、2、4、6 h。Rg1预保护组先用10-8mol/L的Rg1预保护细胞24 h，再用6OHDA处理细胞0.5、1、2、4、6 h，去掉培养液，收集细胞，2 000 r/min离心5 min，沉淀细胞。去掉上清液，用含蛋白酶抑制剂(2 mg/L aprotinin,2 mg/L leupeptin, 1 mmol/L phenylmethylsulfonylfluoride)和磷酸酶抑制剂(1 mmol/L sodium orthovanadate,10 mmol/L NaF)Nonidet P40(20 mmol/L TrisHCl, pH 7.5;150 mmol/L NaCl;1 mmol/