人肝细胞生长因子基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究.doc

　　人肝细胞生长因子基因修饰的大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究 ：朱月蓉, 邢继成, 韩萍, 邱红 【摘要】 　　目的：构建含人肝细胞生长因子(hHGF)基因的骨髓间充质干细胞(MSCs)，获得高表达hHGF的MSCs。方法： 构建含hHGF基因的腺病毒表达载体pDC316HGFIRESEGFP。同源重组法获得含hHGF的重组腺病毒AdHGF。以仅表达GFP基因的重组腺病毒AdGFP为对照，体外分别以AdGFP, AdHGF感染MSCs。荧光激活细胞分选术检测受染细胞的基因表达效率。酶联免疫吸附测定法检测转导细胞培养上清中hHGF表达的浓度和持续时间。结果： 腺病毒表达载体经限制性内切酶切后有2.2 kb的hHGF目的基因片段和5.2 kb的线性化载体片段；目的片段测序结果与基因库中hHGF cDNA序列一致。病毒液AdHGF纯化后滴度可以达到8.02×1010 pfu/ml。FACS检测HGF/MSCs的GFP阳性率达95.19%。HGF/MSCs细胞培养上清中hHGF能持续表达至少14 d；最高浓度达到99 ng/ml。结论： 本实验中腺病毒表达载体构建正确；重组腺病毒液AdHGF滴度高；转导后在MSCs中获得高效、稳定和持续表达的hHGF。该载体达到实验设计要求，为进一步的体内外研究提供了实验依据。 【关键词】 间充质干细胞; 　 肝细胞生长因子； 腺病毒载体 　　［Abstract］Objective: To construct the adenoviral expression vector system containing human HGF cDNA, and produce the virus containing hHGF, and to further study the transducing efficiency and the expression of HGF in MSCs. Methods： The HGF cDNA plificated from the expression plasmid pCMVHGF by PCR，and subcloned into the same site of the plasmid pDC316IRESEGFP vector. The rebinants, named pDC316HGFIRESEGFP, e digestion and sequencing. Then ologous rebination in HEK293 package cells. BMMSCs ined by ELISA. Results： The rebinants pDC316HGFIRESEGFP contained fragments of hHGF. The DNA sequencing of HGF l titer of AdHGF ediated expression of HGF by MSCs aintained for at least 2 onstrated that the adenoviral expression vector system pDC316HGFIRESEGFP containing hHGF cDNA had been constructed correctly, and its effective expression also had been obtained in MSCs. It aterial basis for the next study. 　　［Key esenchymal stem cells; hepatocyte groine购自Invitrogen生物技术公司；小鼠抗大鼠CD34单克隆抗体：美国Santa Cruz Biotechnology公司；小鼠抗大鼠CD90，CD11b/c, CD29单克隆抗体：美国BioLegend公司；小鼠抗大鼠CD45，CD54单克隆抗体，小鼠IgG1 kappa单克隆抗体：美国Catag Laboratories公司；成年Lel)的PBS液冲出骨髓，轻轻混匀，使充分散开；利用密度梯度离心法分离MSCs。获取单个核细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml后，25 cm2培养瓶中培养、传代。整个实验选用3～6代细胞，以确保MSCs的纯一性和未分化性。 　　MSCs可表达多种表面抗原MSCs［5］,我们选取CD34,CD29,CD45,CD11b/c,CD90,CD54作为其鉴定标记。被测细胞浓度用含1%FBS的PBS缓冲液调节至（0.5～1）×106/ml，吸取50 μl标本，加入单克隆抗体10 μl，室温下与相应单抗避光孵育