人脐带间充质干细胞的分离培养及成脂成骨分化.doc

　　人脐带间充质干细胞的分离培养及成脂成骨分化 ：赵磊 王文加 付常皓 韦安慧 颜炜群 【摘要】 目的 建立小胎龄人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)的分离和培养方法，探讨hUCMSCs的成脂、成骨分化潜能。方法 采用Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶消化法从胎龄12～18 esenchymal stem cells,MSC)主要于成人骨髓，与成人骨髓MSC相比，来自于胎儿期的MSC具有更强大的扩增能力、免疫原性低及广泛等诸多优势。目前 文献 报道的人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)多取材于足月生产的胎儿脐带，而从人工流产的较小胎龄胎儿脐带中分离的hUCMSCs未见报道。本实验从胎儿脐带中分离hUCMSCs，初步研究其形态学、免疫表型及分化潜能等基本生物学特性。 　 　1 材料与方法 　　1.1 材料 DMEM/F12培养基、胎牛血清(Invitrogen，美国);Ⅱ型胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶、胰岛素、1甲基3异丁基黄嘌呤、吲哚美辛、β甘油磷酸钠、地塞米松和抗坏血酸(Sigma，美国);流式抗体(CD29FITC、CD44FITC、CD73PE、CD105PE、CD166PE、CD34FITC、CD45FITC、CD40FITC、CD40LFITC、CD80FITC、CD86PE、HLADRPE)(eBioscience，美国);RTPCR仪(Stratagene Mx3000p)。 　　1.2 方法 　　1.2.1 hUCMSCs的分离、培养 取自愿捐献的人工流产胎儿尸体(胎龄12～18 m的组织块，加入分离液(DMEM/F12、10%FBS、0.01%Ⅱ型胶原酶、0.05%透明质酸酶)，在37℃、5% CO2和95%空气的条件下消化过夜。1 500 r/min离心10 min,用含10%FBS的DMEM/F12悬浮细胞，以5×103个细胞/cm2的密度接种。48 h后首次换液，吸弃未贴壁细胞。当细胞生长至占培养皿底面积80%时，用含0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA的消化液消化，按1∶3的比例进行传代培养。 　　1.2.2 细胞免疫表型测定 取第3代hUCMSCs，制成单细胞悬液。分别加入抗人CD29、CD44、CD73、CD105、CD166、CD34、CD45、CD40、CD40L、CD80、CD86、HLADR单克隆抗体，4℃孵育30 min,流式细胞仪检测细胞表型分子阳性率。 　　1.2.3 hUCMSCs 成脂诱导分化 ①诱导过程：第3代细胞生长至占培养皿底面积80%时，将基础培养液更换为成脂诱导液(DMEM/F12、10%FBS、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 1甲基3异丁基黄嘌呤、100 mmol/L吲哚美辛、10 mg/L胰岛素)，每3 d换液。②油红O染色：成脂诱导第14天，吸弃诱导培养液，PBS冲洗，4%多聚甲醛室温固定1 h，70%异丙醇清洗，油红O工作液室温染色10 min，70%异丙醇洗去多余染料。③RTPCR检测：Trizol法提取空白组及诱导组细胞总RNA，逆转录生成cDNA后，进行RTPCR相对定量实验。检测脂肪诱导分化过程中的特异性蛋白PPARγ在0、7、14、28 d 表达量的变化。PPARγ特异性引物(正向：CGAAGACATTCCATTCACAAG，反向：CTCCACAGACACGACATTC)，GAPDH作为内参照(正向引物：GACAGTCAGCCGCATCTTC，反向引物：ACTCCGACCTTCACCTTCC)。反应条件95℃，30 s;58℃，60 s;72℃，60 s。40个循环。 　　1.2.4 hUCMSCs成骨诱导分化 ①诱导过程：第3代生长至占培养皿底面积60%时将基础培养液更换为成骨诱导液(DMEMLG、10%FBS、50 μg/ml抗坏血酸、10 mmol/L β甘油磷酸钠、108mol/L地塞米松)。每3 d换液。②茜素红染色：成骨诱导至第14天，吸弃诱导培养液，PBS冲洗，95%乙醇室温固定10 min，双蒸水冲洗，茜素红工作液37℃孵育30 min,双蒸水冲洗。③实时定量(RT)PCR检测：Trizol法提取空白组及诱导组细胞总RNA，逆转录成cDNA后，进行RTPCR相对定量实验。检测成骨诱导分化过程中的特异性蛋白Osteopontin在0、7、14、28 d表达量的变化。Osteopontin特异性引物(正向：CGACGATGATGACGATGATG，反向：CGACTGTAGGGACGATTGG)。反应条件95℃，30 s;58℃，60 s;72℃，60 s。40个循环。 　　2.3 hUCMSCs向脂肪细胞定向诱导分化 加入成脂肪细胞诱导液后，细胞几乎停止繁殖，胞体