喹硫平对小鼠脑缺血后胶质增生及IL1β表达的影响及其作用机制.doc

　　喹硫平对小鼠脑缺血后胶质增生及IL1β表达的影响及其作用机制 ：房绍宽 白晶 周春奎 吴江 【摘要】 目的 研究喹硫平对小鼠脑缺血后胶质增生及白介素(IL)1β表达的影响及其作用机制。方法 小鼠分为假手术组、药物对照组、缺血组、药物保护组;采用激光共聚焦显微镜方法观察脑缺血后胶质增生及IL1β表达情况;采用g/kg)和甲苯噻嗪(15 mg/kg)麻醉，麻醉后沿腹正中线切口，分离双侧颈总动脉并用棉线阻断双侧颈总动脉血流60 min，之后撤掉棉线观察血液复流，然后缝合腹正中线切口。假手术组执行相同程序，但不闭塞双侧的颈总动脉。手术后用热毯维持小鼠在正常体温。 　　1.3 给药方法 喹硫平溶于无菌生理盐水中，参照实验方法〔3,4〕，采用喹硫平10 mg/kg，缺血手术后给予小鼠喹硫平10 mg/kg或生理盐水腹腔注射，1次/d，共4 g/kg腹腔注射;药物保护组闭塞双侧的颈总动脉然后给予喹硫平10 mg/kg腹腔注射，每组小鼠12只。 　　1.5 方法 　　1.5.1 激光共聚焦显微镜检测神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)IL1β共表达 将组织切片在二甲苯中浸3次，正常山羊血清封闭，分别滴加50 μl的1∶1混合的兔抗大鼠GFAP(1∶100)和小鼠抗大鼠IL1β(1∶200)，设空白对照〔无一抗，加磷酸盐缓冲液(PBS)〕和抗体特异性对照(加一抗不加二抗，加二抗不加一抗)，所有切片同时染色。切片一抗及二抗加入后，置于湿盒内，4℃过夜。激光共聚焦显微镜观察。 　　1.5.2 蛋白质印迹(in。蛋白定量后，用同一蛋白含量上样跑十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)，然后转移到尼龙膜上，封闭液封闭，加入含有一抗(兔抗NFκB p50和p65特异性抗体)的3 ml反应液，4℃温育2 h,然后加入含有二抗(羊抗兔IgG)的3 ml反应液，显色拍照。 　　1.6 统计学分析 采用SPSS13.0软件，计量资料以x±s表示，采用两因素方差分析比较各组间的差异，然后进行t检验。 　　2 结 果 　　图1 缺血再灌注后4 w GFAPIL1β海马齿状 　　回区激光共聚焦显微镜观察(×400) 缺血组与假手术组比较，GFAPIL1β共表达阳性细胞(黄色)数量明显增加(Plt;0.01);药物保护组与缺血组比较GFAPIL1β共表达阳性细胞(黄色)数量明显减少(Plt;0.01)。见图1。缺血组与假手术组比较p65蛋白表达量增加(Plt;0.05);药物保护组与缺血组比较p65蛋白表达量减少(Plt;0.05)。见图2。缺血组与假手术组比较p50蛋白表达量增加(Plt;0.05);药物保护组与缺血组比较p50蛋白表达量减少(Plt;0.05)。见图3。 　　星形胶质细胞在维持神经元正常活性方面发挥重要作用，包括谷氨酸的摄取、释放，钾离子及氢离子的平衡缓冲以及水的转运。脑缺血后反应性的星形胶质细胞增生，但过度增生活化的胶质细胞可以释放有害因子如肿瘤坏死因子(TNF)、IL1β、干扰素(IFN)等导致迟发性神经元死亡(DND)。IL1β可以通过刺激内皮细胞表达白细胞黏附分子，使白细胞聚集在缺血脑组织，引发炎症反应加重脑组织损害〔9〕。过度增殖的胶质细胞尤其是胶质疤痕的形成不仅可影响到神经元轴突的生长、突触的重建及阻断脑组织微循环〔10〕，而且还是脑血管病后癫痫发病的根源，因此胶质细胞对神经元的作用具有利弊双重性。抑制脑缺血后过度的胶质细胞增生及炎症反应成为脑缺血后神经功能重建目标的重要途径之一。喹硫平在改善脑缺血后精神症状同时也能够减轻脑缺血后认知功能的损伤〔11〕。 　　颈总动脉闭塞(CCAO)能阻断85%的脑血流并足以诱导小鼠神经元损伤而且死亡率仅有5%，经过30、60、90 min模型发现，60 min CCAO在小鼠模型中产生明显的急性神经变性和记忆损伤〔12，13〕。海马是应激激素产生的器官，同时也是对缺血很敏感的区域。本文采用激光共聚焦显微镜观察方法评价脑缺血后的胶质细胞增生和炎症反应及喹硫平对脑缺血后炎症反应的作用。GFAP表达量的增加通常被作为星形胶质细胞在中枢神经系统(S)损伤后活化和增殖的标志。本研究发现喹硫平减少脑缺血后IL1βGFAP的共表达，减轻脑缺血后的胶质增生及IL1β的表达。 　　NFκB是一种在机体受到应激性刺激后活化并参与调控一系列基因转录的关键性核转录因子，作为一种在转录水平调控基因表达的因子，是各种信号转导途径的枢纽环节。NFκB在脑缺血损伤中促进炎症的发生 发展 、诱导细胞凋亡、介导自由基损伤〔14〕。脑缺血损伤发生后，NFκB上调细胞因子IL1β的表达，IL1β反过来又可以激活NFκB，从而使NFκB活化在组织间不断扩散，加重了炎症反应