小鼠高迁移率族蛋白1cDNA克隆、原核表达与鉴定.doc

　　小鼠高迁移率族蛋白1cDNA克隆、原核表达与鉴定 【摘要】 目的： 克隆并原核表达小鼠高迁移率族蛋白1（high mobility group box1,HMGB1）。方法： 从小鼠脾脏细胞中提取总RNA，应用RTPCR获得小鼠HMGB1cDNA,经PCR扩增小鼠HMGB1基因；通过TA克隆将该基因构建到PMD18T载体中，测序鉴定；将该基因插入pET28a(+)表达载体，IPTG诱导后，可表达相对分子质量约30 kDa的蛋白。蛋白质印迹鉴定表达的目的蛋白。结果： 经RTPCR扩增得到648 bp的DNA片段，序列分析显示与基因库中报道的已知序列完全一致；构建了含有HMGB1编码序列的原核表达载体，经诱导表达、蛋白质印迹鉴定，获得相对分子质量约30 kDa的融合蛋白。结论： 成功克隆和表达了小鼠HMGB1基因，为HMGB1蛋白的功能试验奠定了基础。 【关键词】 高迁移率族蛋白； 克隆； 原核表达 ［Abstract］ Objective: To clone and express mouse high mobility group box chromosomal protein1(HMGB1)gene.Methods： Total RNA mouse spleen cells, and the ouse HMGB1 gene. It might provide a foundation for further study on the protein of HMGB1 function. ［Key obility group box1; clone; prokaryotic express 高迁移率族蛋白1(high mobility group box1,HMGB1)是高迁移率族蛋白超家族的成员之一，是一种含量丰富的非组蛋白核蛋白［1］。编码区由648 bp组成，编码215个氨基酸，在核内具有调节基因转录和表达等作用；在细胞外HMGB1可以诱导某些炎症因子的释放，作为一种晚期炎症因子参与脓毒血症的发病过程［2,3］。最近研究表明，HMGB1也参与自身免疫性疾病的发病过程，如类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮等［4,5］。但其确切的作用机制尚未完全清楚。本研究克隆并表达了小鼠HMGB1，经鉴定表明获得了小鼠HMGB1的融合蛋白，为进一步探讨HMGB1对免疫细胞的调节及其在类风湿性关节炎中的作用机制，寻找类风湿性关节炎 治疗 的新途径奠定了基础。 1 材料与方法 1.1 材 料 大肠埃希菌Rossta，DH5α，质粒pET28a(+)为本室保存；Trizol购自Invitrogen 公司；DNA Gel Extraction Kit、各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶、rTaq酶、pMD18T 载体购自TaKaRa宝生物工程(大连) 有限公司；AMV Reverse Transcriptase， RNase Inhibitor均购自Sigma公司;鼠抗HisTag单克隆抗体购自Omiga公司;HisTrapHP购自GE Health care公司。 1.2 方 法 1.2.1 PCR引物和设计 根据基因库中小鼠HMGB1 mRNA序列，设计编码区的特异性引物：上游引物序列为P1: 5′CGAGCTCATGGGCAAAGGAGATCCT3′,下游引物序列为P2： 5′CCAA GCTTTTATTCATCATCATCATC3′，在上下游引物5′端分别插入Sac Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点和保护碱基，以便于酶切、克隆。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 1.2.2 总RNA的提取及RTPCR 颈椎脱臼处死成年小鼠，无菌取脾脏，经充分研磨过滤后，用Trizol一步法提取总RNA，逆转录获得cDNA模板，然后用HMGB1编码区特异性引物进行PCR扩增。循环条件为：94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 45 s, 共30 个循环。取5 μl PCR产物, 用1%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后, 紫外透射分析仪观察结果。 1.2.3 TA克隆PCR扩增产物到PMD18T载体 回收PCR产物,TA克隆PMD18T。转化大肠埃希菌DH5α感受态,培养后挑取单个菌落、提取质粒、Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，将阳性重组子命名为PMD18THMGB1并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序证实。 1.2.4 HMGB1表达载体的构建和诱导表达 用Sac Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切PMD18THMGB1和表达质粒pET28a(+)，胶回收后连接转化大肠埃希菌Rossta感受态细胞。挑取生长良好的菌落并接种于3 ml LB培养基中，37℃，250 r/mi