微波辐射对PC12细胞突触素I表达的影响及其机制.doc

　　微波辐射对PC12细胞突触素I表达的影响及其机制 【摘要】 目的: 探讨微波辐射对PC12细胞突触素I表达及其磷酸化水平的影响, 并通过对其相关影响因子BDNF及其受体TrkB改变的探讨, 初步揭示突触素I改变的机制。方法: 采用30 mAPK信号通路, 影响突触素Ⅰ的表达和磷酸化[1]。由于原代神经元的培养条件要求较高, 且细胞数量有限, 在基因水平干预较难操作, 故在实验研究中受到很大的限制。PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系, 在神经生长因子(nerve groa公司; NGF、 兔抗突触素ⅠIgG和兔抗磷酸化的突触素ⅠIgG均购自美国Chemicon公司; 兔抗TrkB IgG购自武汉博士德生物工程有限公司; 兔抗BDNF IgG、 生物素化羊抗兔IgG、 HRP链亲和素和DAB均购自北京中杉金桥生物技术有限公司; 蛋白A琼脂糖购自美国Santa crutz公司; 用于BDNF、 TrkB、 突触素I和βactin PCR扩增的成对引物序列由北京奥科公司合成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 PC12细胞培养 复苏PC12细胞, 传3代后, 采用0.05 mg/L NGF, 10 mL/L胎牛血清的DMEM诱导其分化, 7～14 d后可见其有明显突起长出, 用于下一步实验。 　　1.2.2 辐射方法 PC12细胞接种于35 mm培养皿中, 置于布满吸收材料的微波室内, 放在辐射台上接受辐射, 平均功率密度为30 mVRT, 42℃ 60 min; 之后70℃反应10 min, 4℃或冷冻保存。以βactin为内参照进行PCR, 突触素I cDNA扩增条件为94℃ 3 min, 94℃ 30 s, 57℃ 45s（BDNF 55℃ 45 s; TrkB 56℃ 30 s; βactin 54℃ 30 s）, 72℃ 45 s, 72℃ 5 min; 均为25个循环。取5 μL PCR产物与1 μL DNA上样缓冲液混匀后在10 g/L的凝胶上电泳, 用凝胶成像系统扫描分析。 　　1.2.5 免疫细胞化学和IASⅡ图像分析仪对BDNF和TrkB的免疫细胞化学结果进行积分光密度（integral optical density, IOD）和平均光密度（mean optical density, MOD）测定。IASⅡ图像分析仪, 测目的条带的IOD值, 将扫描值与βactin扫描值相比, 然后以样本/内参照的比值表示突触素I/磷酸化的突触素I的表达水平。 　　1.2.6 免疫共沉淀方法检测PC12细胞BDNF和TrkB相互作用 于辐射后3 h、 9 h、 1 d和2 d, 取300 μg PC12细胞蛋白加裂解液补足至250 mL; 加5 mL兔抗BDNF多抗, 摇床4℃震摇1 h; 加20 μL蛋白A琼脂糖, 4℃摇过夜; 2500 r/min离心5 min; 弃上清, 收取琼脂糖沉淀; 加入冰浴裂解液洗4次, 离心取沉淀; 加入20 μL裂解液及20 μL上样缓冲液; 100℃水浴3 min, 4000 r/min离心10 min, 使琼脂糖沉淀, 取上清; 进行IASⅡ图像分析仪, 测目的条带的IOD值。 　　1.2.7 统计学分析 文中数据以均数和标准差（x±s）表示, 采用SAS软件进行单因素方差分析, Plt;0.05者具有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 PC12细胞氨基酸递质释放的改变 30 m2辐射后1 h PC12细胞释放的Asp、 Glu、 GABA和Gly均减少（表1）。表明30 m2辐射后PC12细胞间信息传递受抑制。 　　表1 微波辐射后1 h PC12细胞氨基酸递质释放的改变（略） 　　Tab 1 Change of the release of amino acids in PC12 cells at 1 h after microRNA的改变: 30 m2辐射后3～9 h见突触素ⅠmRNA减少, 1 d增加, 2 d基本恢复（图1）, 提示微波辐射后PC12细胞突触素Ⅰ转录存在异常。(2)突触素Ⅰ和磷酸化的突触素Ⅰ表达的改变: 30 m2辐射后9 h～2 d突触素Ⅰ表达减少, 但有恢复趋势; 磷酸化的突触素Ⅰ表达在辐射后3～9 h减少, 1 d增加, 2 d又见减少（图2和表2）; 提示微波辐射后PC12细胞的囊泡锚定存在障碍。 　　图1 微波辐射后PC12细胞突触素ⅠmRNA的变化（略） 　　Fig 1 Change of synapsin I mRNA in PC12 cells after microicro2 radiation, respectively. 　　表2 微波辐射后PC12细胞突触素Ⅰ和磷酸化突触素Ⅰ表达改变的定量分析结