桑叶多糖PMP12的分离纯化及结构初步分析.doc

　　桑叶多糖PMP12的分离纯化及结构初步分析 ：赵明, 常钰, 王佩香, 张磊, 欧阳臻 【摘要】 目的： 从桑叶中分离纯化获得均一多糖PMP12,并研究其组成及初步结构。方法： 桑叶经热水提取乙醇分级沉淀,脱蛋白、脱色,经DEAE纤维素和Sephadex G100凝胶柱层析,得到一个均一多糖组分PMP12,采用气相(GC)、高效液相(HPLC)、红外(IR)、核磁(NMR)、Smith 降解和糖醛酸还原等方法分析其组成和初步结构。结果： PMP12由鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)和葡萄糖醛酸(GluA)组成,其摩尔比为Rha∶Ara∶Gal∶GluA=1∶1.56∶1.57∶1.08;PMP12主链主要是以β1→3糖苷键连接的鼠李糖,侧链主要是以β1→2糖苷键及β1→4糖苷键连接的阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖醛酸。结论： 测定分析了桑叶多糖PMP12的组成和初步结构,为桑叶多糖的进一步研究提供依据。 【关键词】 桑叶; 多糖; 分离纯化; 结构分析 　　[Abstract] Objective: To study the isolation,the position and characterization of polysaccharide PMP12 from Mulberry leaves. Methods： Mulberry leaves oved by TCA and it ith degradation and uronic acid reduction and so on. Results： PMP12 is made up of rhammose,arabinose, galactose and glycuronic acid olarity rate of 1∶1.56∶1.57∶1.08; In the PMP12, the main chain is made up of β1→3linkedrhammose.The side chains are β1→2 and β1→4linkedarabinose,galactose and glycuronic acid. Conclusion： The structure of PMP12 ined from mulberry leaves.These ith 降解和糖醛酸还原等方法对其组成和初步结构进行分析和研究。 　 　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　桑叶采集于江苏大学桑树园,经欧阳臻教授鉴定为桑科植物桑Morus alba L.的叶,干燥后,粉碎,备用。DEAE纤维素(P12的提取、分离与纯化 　　取粉碎后的桑叶1 kg,依次用石油醚、乙酸乙酯和95%乙醇回流脱脂,残渣干燥后加5倍量蒸馏水,90 ℃提取4次,合并提取液,减压浓缩。加30%的三氯乙酸脱蛋白,离心,除去变性蛋白,浓缩至一定体积,用氨水调pH值至8.0,加入过氧化氢进行氧化脱色(45 ℃保温1 h)。透析除去过氧化氢及有机溶剂和小分子杂质后,浓缩至一定体积,加95%乙醇,使含醇量达到50%,于4 ℃放置过夜，离心收集沉淀，复溶于水，再次醇析，冷冻干燥后得粗多糖组分MP1。经DEAE52纤维素和Sephadex G100凝胶柱层析,得较纯的水溶性多糖组分PMP12。 　　1.4 高效凝胶渗透色谱(HPGFC)测定多糖的纯度及相对分子质量[9] 　　样品及系列标准多糖分别经 HPGFC分析。色谱条件:Jasco HPLC 1500液相色谱系统,TSKGEL G4000PP12 10 mg,加入2 mol/L的硫酸2 ml,封管,100 ℃水解6 h,中和水解液,离心,冷冻干燥;取各标准单糖和水解后的糖样,制备成糖腈乙酰化物,进行气相色谱分析。色谱条件:HP1 21 000 mm×0.2 mm弹性石英毛细管色谱柱;载气为氮气;检测器为氢火焰离子化检测器(FID);柱温的起始温度130 ℃保留5 min,程序升温4 ℃/min,中止温度240 ℃;汽化温度280 ℃;检测器250 ℃。 　　1.6 糖醛酸的还原[10] 　　称取多糖PMP12 20 mg于10 ml试管中,加2 ml水溶解,用0.1 mol/ml HCl调pH值至4.8。加入40 mg 水溶性的碳化二亚胺试剂(EDC),室温下反应1 h,同时用0.04 mol/L HCl调节pH值使之保持在4.8。将反应物转移至50 ml烧杯中,加入2 ml新配的2 mol/L硼氢化钾,于50 ℃水浴反应1 h,再加入2 ml新配的2 mol/L 硼氢化钾,于50 ℃水浴反应50 min,加乙酸终止反应。反应物透析,冷冻干燥,干燥后的样品按上述操作再重复还原2次。冻干,