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微生物限度检查分析方法验证方案及报告 2013年03月 验证方案目录 1、人员分工与职责 2、目的 3、适用范围 4、接受标准 5、所需仪器校验情况 6、验证方法 7、方案报告 人员分工与职责 QA 经理 审核验证文件 QC 副经理 组织指导验证工作 QC 副经理 整理验证文件 QC 分析员 负责验证项目的分析测试 QC 分析员 负责验证项目的分析测试 QC 分析员 负责验证项目的分析测试 QC 分析员 负责验证项目的分析测试 保济丸微生物限度检查分析方法验证方案 目的：建立保济丸微生物限度分析方法，包括细菌数、霉菌数及酵母菌数的检查以及控制菌的检查，并对分析方法进行验证，以证明所采用的方法适合于保济丸微生物限度的检查，为日常的检测工作提供依据。 3 可接受的标准：2010年版《中国药典》一部 3.1细菌、霉菌数及酵母菌计数方法的验证可接受的标准 3.1.1在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。 3.1.2在3次独立的平行试验中，试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。 3.2控制菌检查验证可接受的标准 3.2.1阴性菌对照组不得检出阴性对照菌，试验组检出试验菌。 3.2.2阴性对照应无菌生产，供试品应无菌生长。 所需仪器校验情况：应有所需仪器检定时间、检定部门及有效期。 验证方法： 5.1 细菌、霉菌数及酵母菌计数方法的验证（直接接种法） 5.1.1试验用的菌种： （1）金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ）[CMCC(B)26003] （2）大肠埃希菌(Escherichia coli) [CMCC(B) 44 102] （3）枯草芽孢杆菌（Bacillus　subtilis）[CMCC(B)63 501] （4）白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)98 001] （5）黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98 003] 5.1.2培养基及稀释液 培养基：改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基。 稀释液：0.9%氯化钠溶液、PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 5.1.3 试验步骤 5.1.3.1 培养基的配制和灭菌 将改良马丁琼脂培养基、营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基按照购买厂家的使用说明书进行配制，在115℃的温度条件下灭菌30min冷却后备用。 5.1.3.3菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养琼脂培养基中，在30~35℃培养18~24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，在23~28℃培养24~48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50~100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，在23~28℃培养5~7天，加入3~5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50~100cfu的孢子悬液。 5.1.3.4供试液的制备 取保济丸10g，加入90ml PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中溶解，混匀，作为1:10的供试液。取1：10的供试液10ml，加入90ml PH7.0的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀，作为1:100的供试液。 5.1.3.5具体操作 a试验组 用吸管分别取上述1:10、1：100供试液1ml和含试验菌50-100CFU的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，每种试验菌平行测定两份。前3种菌加入平皿中并加入营养琼脂培养基，后2种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。 b 菌液组（测定所加的试验菌数） 取和试验组一样多的试验菌加入平皿后培养。 c 供试品对照组 取和试验组一样稀释级别的供试液1ml，加入平皿中，平行操作4份，2份加入营养琼脂培养基并培养，另2份加入玫瑰红钠琼脂培养基并培养。 d 稀释剂对照组 用吸管分别取稀释液1ml和含试验菌50-100CFU的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液，置平皿中，每种试验菌平行测定两份。前3种菌营养琼脂培养基，后2种菌加入平皿中并加入玫瑰红钠琼脂培养基。 e阴性对照 用吸管分别取PH7.