培养基制备与灭菌.pptVIP

实验四 培养基的制备与灭菌;一、实验目的;二、基本原理;三、实验器材;四、实验内容;（1）称量：按照培养基配方，正确称取各种原料放于烧杯中； （2）溶解：在上述烧杯中加入所需水量（根据实验需要可加入蒸馏水或自来水）搅匀，加热溶解。应在药品全部溶解后加水补足加热过程所蒸发的水分。配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基煮沸，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全融化，并不断搅拌，以免糊底烧焦，最后加水补足失去的水分； （3）调PH值：用1N NaOH或1N HCl调PH至7.2，尽量避免回调； （4）过滤：用过滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求，此步可以省去。 ;2. 豆芽汁葡萄糖（或蔗糖）培养基（用于分离、培养酵母菌及霉菌） 成分： 黄豆芽 10g； 葡萄糖 5g； 琼脂 1.5-2.0g； 水 100mL； 自然PH 称新鲜黄豆芽10g，放烧杯中，再加入100 mL自来水，小火煮沸30分钟，用纱布过滤，最后加水补足量，制成10%豆芽汁。再加入葡萄糖5g，煮沸后加入琼脂1.5g，继续加入使之融化，补足失水。;3. 马铃薯葡萄糖培养基（分离霉菌用） 制法：将马铃薯去皮，并切成薄片，立即放入水中。否则马铃薯易氧化变黑。每200克马铃薯加自来水1000 mL。80℃温水浸泡1小时，用纱布过滤，然后稀释到1000 mL。15磅/寸2灭菌20分钟，即为20%的马铃薯浸汁，贮存备用。 配制培养基时，按100 mL马铃薯浸汁加入葡萄糖2克，琼脂1.5-2.0克。 4. 无菌水的制备 在每个250 mL锥形瓶内装99 mL自来水（或生理盐水），在每个小试管内装4.5 mL自来水（或生理盐水），塞上棉塞，15磅/寸2灭菌20分钟待用。;（二）培养基的分装及棉塞的制作 1. 培养基的分装 根据不同需要，可将制好的培养基分装入试管或锥形瓶内。注意不要使培养基沾染管口或瓶口，以免浸湿棉塞，引起污染。 试管分装时，取玻璃漏斗一个，装在铁架上，漏斗下连一个橡皮管和另一玻璃管嘴相接，橡皮管上加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃管，使培养基直接流入试管内（见图2-1） 用锥形瓶分装培养基时，容量应不超过容积的一半为宜。 ;2. 棉塞的制作 为了过滤空气，避免污染，试管或锥形瓶口需用棉花堵塞（脱脂棉易吸水，勿用）。为了节省棉花或节省时间，在配置实验临时所用的无菌水和培养基时，也可以用金属试管帽代替棉塞。装液体培养基的锥形瓶口，可包扎6-8层纱布以代替棉花。 制作棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可以用折叠卷塞法制作棉塞（见图2-2）。;棉塞的2/3应在管内，上端露出1/3，便于提拔。如制作时不慎沾上培养基，则不可再用。在棉塞和平口外要包以厚纸，或将塞好后的试管集中放在铁丝筐内，上面盖以厚纸，用线绳扎好，准备灭菌，避免灭菌后冷水淋湿棉塞，并防止接种前培养基水分散失。 上面配制好的各种培养基，分装于锥形瓶内和试管中，分别加以捆扎，用铅笔做好标记。然后放铁丝筐内，灭菌备用。;3. 斜面培养基制作法 将已灭菌的装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面（图2-3）。制得的斜面以稍有凝结??析出者为佳。如果制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。 4. 平板培养基制作法 灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好从中取出1-2管（瓶），放在30-37℃恒温箱中保温1-3天，不长菌者即证明灭菌已彻底，再放阴暗处保存。;（三）玻璃器皿的洗涤和包装 1. 玻璃器皿的洗刷：玻璃器皿的使用前必须洗刷干净。锥形瓶、试管、培养皿等浸入水中洗涤，用毛刷和洗衣粉洗刷，然后再用水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗。洗刷干净的玻璃仪器在电热干燥箱中烘干后备用。 2. 玻璃器皿灭菌前的准备工作： （1）培养皿又称双碟或平皿，由一底一盖组成一套。可以每套单独使用纸包装，也可将几套一起用纸包装； （2）移液管应在距管口约1-2毫米处用铁丝塞入少许棉花（约1-1.5厘米长）；以防止细菌吸入口中，并避免将口中细菌吹入管内。棉花要塞的松紧适宜。炊时以能通气但不使棉花滑下为准。江塞好棉花的移液管尖端，放在4-5厘米宽的长条纸的一端，约成45℃角，折叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌上向前搓转，以螺旋