ELISA试剂配制及实验流程—BDY.docVIP

ELISA试剂配制及实验流程 ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。以双抗体夹心法举例说明。 试剂配制： 　　(1)　包被缓冲液(PH9.6 +0.2 0.05M 碳酸盐缓冲液)： 　　　　　　Na2CO31.59g 　　　　　　NaHCO3　 2.93g 　　　　　　加蒸馏水至1000ml。（用时稀释成1x，加0.1%BSA） (2)　洗涤缓冲液(PH7.4 0.15M PBST)： 0.05%Tween-20 0.5ml 加在PBS缓冲液1000ml中。 PBS缓冲液： 　　　　　　KH2PO4 　　　　　 0.27g 　　　　　　Na2HPO4·12H2O　　 3.58g 　　　　　　NaCl　　　　　　 　 8g 　　　　　　KCl　　　　　　　　 0.2g 　　　　　　加蒸馏水至1000ml。 (3)　封闭缓冲液： 　　　　　　牛血清白蛋白(BSA) 2% 2g 　　　　　　（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。 　　(4)　稀释液： 　　　　　　牛血清白蛋白 0.1 % 0.1g 　　　　　　加PBS 缓冲液100ml。 　　(5)　底物缓冲液(PH5.0)： 　　　　 0.2M Na2HPO4(无水28.4g/L，带12结晶水71.7g/L) 取25.7ml 　　　　 0.1M 柠檬酸(无水19.2g/L，带1结晶水21.01g/L) 取24.3ml 　　　　 加蒸馏水至100ml。 (或Na2HPO4·12H2O 1.84g 柠檬酸·H2O 0.51g 加蒸馏水至100ml) 　　(6)　TMB(四甲基联苯胺)显色液（显蓝色）：HRP- 　　　　 TMB(2mg/ml水) 0.05ml 　　　　 底物缓冲液 　　　 0.95ml 　　　　 30% H2O2　　 　 0.001ml 总体积1ml。 TMB, 1mg/ml-DMSO溶解 (7) 或配OPD(邻苯二胺)包被缓冲液（NaHCO3-Na2CO3缓冲液） 量取0.2M?NaHCO3?17mL，0.2M?Na2CO3?8?mL溶于75mL双蒸水中PBS(PH7.2) 称取NaCl?8.0g,?Na2HPO4?12H2O?2.9g，KCl?2.0g，KH2PO4?0.2g溶于1000?mL双蒸水中洗涤液（PBST?PH7.2） 量取0.5mL?Tween-20溶于1000?mL?PBS中酶标抗体稀释液 量取4mL新生小牛血清CS溶于96mL?PBST中底物液 ???称取OPD?4mg溶于40?mL?3%H2O2的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中，临用前配制磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液 量取24.3?mL?0.1M柠檬酸钠，25.7?mL?0.2M?Na2HPO4，加双蒸水至100?mL明胶封闭液 称取1g明胶溶于100?mL?PBS(PH7.2)中小牛血清封闭液 量取10mL小牛血清溶于90mL?PBS(PH7.2)中酶反应终止液（2M?H2SO4） 量取10mL浓H2SO4溶于80mL双蒸水中 ELISA步骤： ----------根哥给的方法----------- 1）实验材料 目的抗原 BSA或其他对照抗原(15uμg/ml) PBS 96孔ELISA板； 96孔ELISA封板膜； 移液枪 封闭液：5%脱脂牛奶(w/v)-PBS 抗血清 0.1% (v/v) Tween20-PBS HRP-兔抗鼠多克隆抗体 TMB(A，TMB：称取固体TMB 溶于DMSO 配成1mg/ml液体，避光保存，最好4度用前要检查其状态，若有凝固，可用手温将其融化；B，底物缓冲液为0.1M 醋酸钠-醋酸缓冲液，pH6.0；使用时用底物缓冲液稀释A液至100μg/ml；50ml缓冲液加入10μl 30% H2O2)。 稀硫酸(1M) 酶标仪 2）实验步骤 (1). 用PBS缓冲液将抗原(目的抗原、BSA或其他对照抗原)稀释至0.2-10μg/ml。。 (2). 每孔加入100μl抗原稀释液，4℃包被过夜。 (3).以用PBS洗3次(每次每孔200μl，每次洗5min)。每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h。 (4). 弃封闭液，以0.1% Tween 20-PBS洗板3次后(每次每孔200μl，每次洗5min)，然后用PBS洗3次(每次每孔200μl，每次洗5