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t-DNA插入突变体的鉴定 实验时间：2012年5月18日 摘要 Ti质粒是上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将感兴趣的基因改造插入到T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化，得到含有突变的植株。本实验即检测所得植株是否为T-DNA的插入突变体。 引言 Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。若将Ti质粒进行改造，把感兴趣的基因放进T-DNA序列中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。 本次实验中，采用液CTAB（或者TSP法）提取拟南芥植株的DNA，然后PCR将所获DNA扩增，在之后采用琼脂糖凝胶电泳技术，分离处长度不一的DNA带，以确东样品是否为T-DNA插入突变纯和体。 PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应是体外核算扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断。（PCR基本原理如右图） DNA含有PO43-基团，在pH8.0 Buffer（本实验中为TAE）中带负电, 在电场中向正极移动。自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；同样条件对Marker电泳；起到鉴定的作用。不同浓度的琼脂糖凝胶对应线状DNA分子分离范围不同。（如下图） 实验材料 试验材料 待检测拟南芥植株； 液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24:1），无水乙醇，70%的乙醇，TE； 引物（Lp、Rp、Bp），反应缓冲液，dNTP，ddH2O，耐热聚合酶； 琼脂糖，TAE缓冲溶 离心机，恒温槽，PCR仪，电泳仪，电子天平，冰块； 离心管（0.2ml、0.5ml），移液枪等必要的实验器材。 实验步骤 CTAB法提取DNA 用液氮100mg幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离心管中加入预热至65℃的600 μl 的2×CTAB提取液，轻摇混匀。 65℃水浴30min，其间轻摇混匀。 向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清液入新管。 向上清液中加入2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20 ℃ 下30 min ，12000 rpm离心15 min，弃上清。 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 将沉淀晾干，加20-50 μl TE (pH 8.0)， 65℃水浴30 min溶解DNA。 PCR步骤 配置反应体系：主要包括DNA模板，引物，反应缓冲液，dNTP，ddH2O，耐热聚合酶。 25ul体系：ddH2O 16ul，缓冲溶液2.5ul，镁离子2ul，dNTP 0.5ul，引物1ul，DNA模板2ul，taq酶0.2ul。 配好体系，轻摇混匀，4000rpm离心10秒钟。 设定反应程序： 预变性：94℃，5min； 循环部分：变性解旋94℃，40sec；退火53℃，50sec；延伸72℃，80sec，循环35次； 延伸部分：72℃，10min； 保存：4℃下可以保存1-2天 。 琼脂糖凝胶电泳 配置40ml1.6%的琼脂糖凝胶：称取0.640g的琼脂糖放入锥型瓶中，加入40ml　TAE加热使其溶解，注意不要使其暴沸； 将加热溶解的琼脂糖凝胶稍冷却，大约到50℃，将所得溶液移入琼脂糖槽中，使之冷却成型； 将冷却凝固的琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入TAE电极缓冲缓，直到液体稍浸没凝胶； 向所得的25ul PC体系中加入5ul 6×loading buffer，轻摇混匀； 以此向点样空中滴加样品，marker DNA滴加约6.5ul，其他的样品，每个点样空滴加20ul； 点样完成后，加上110v电压，