CRISPR protocol-Cas9介导的同源重组.pdfVIP

Cas9 介导的同源重组 Cas9 介导同源重组 （HDR ）的基本操作和做基因敲除（KO ）基本一致（Fig 1 ），除了 需要多引入一条修复模板（repair template ）。顺利的情况下整套操作下来至少需要 4 周时间 （心急吃不到热豆腐嘞~~ ），其中单克隆的获取和鉴定是最大的限速步骤（小伙伴在这一步 可以开开脑洞优化一下）。 WT 的Cas9 （这里指spCas9 ）是引起双链断裂（DSB ），进而引起NHEJ（nonhomologous end joining ，意思就是断裂的末端重新连起来 ，这一过程容易产生indels ）或者 HDR （修复 模板存在）；但有一个突变体（D10A ）却只保留了切口酶的活性（nickase ） （spCas9n ）， 一般不会引起NHEJ ，但会引起HDR （修复模板存在）。大家周知WT 的 spCas9 会有些微的 脱靶效应，因此利用 cas9n 代替 WT 的 cas9 产生 deletion （需要两条sgRNA 同时作用）或 者 HDR 可以降低一部分脱靶的效果 （Fig. 2 ）。 Fig 1. Cas9 敲除/敲入基因时间安排(1)。 Fig 2. Cas9 (D10A)突变体（Cas9n ）只保留 nickase 活性。这一突变体不会引起NHJE。 如果同有两条 sgRNA 靶向一个 gene 的不同位点，Cas9n 会引起一个片段 （两个sgRNA 之 间）的deletion。修复模板存在的情况下可以引起 HDR(1)。 今天的内容主要讲讲利用 Cas9 怎么做同源重组（修复）（HDR ）。其实基因的敲入（KI ） 也是一模一样的做法。 一、 同源臂的设计：和做 KO 比较，做HDR 最大的不同就是要有同源模板的 存在。同源模板有以下两种类型(Fig. 3): 1. 单链模板：手动设计单侧同源臂长度不低于40 nt ，但强烈推荐设计~90 nt。 找引物合成公司合成较长单连 oligo 即可(90+90+Insertion) ，针对正链或者反链合成都 ok。没有必要使用 PAGE 纯化。为了验证方便，建议引入酶切位点（RFLP 法 ）。当然， 同源模板也可以是线性化的双链 DNA 片段，可以通过线性化载体或者基因合成/PCR 获得。溶解成终浓度 10 M ，-20C 分装保存。 2. 线性化双链模板：同源臂在 1000 nt 左右 ；线性化载体或者PCR 产物作为转染 模板； 二、 转染 ： 5 12-孔板：~210 cells/well (50-70% confluency) 500 ng Cas9 （或者Cas9n ）-sgRNA 1 l 单链同源模板 （10 M ） 三、 鉴定方法： 通过GFP 或者puromycin 富集成mixture ，然后直接PCR 测序或者利用Restriction-fragment length polymorphism (RFLP) 分析方法. 四、 结论： 1. WT 的Cas9 直接切割双链，引起 DSB ，重组效果最好，但会引起脱靶； 2. 单链 oligo 作为模板优于线性化载体作为模板； 3. 貌似反义 oligo 的模板效果优于正链。 Fig 3. Cas9 介导同源重组(1) 五、 多说几句 目前这中修复基因的方法比较适合在细胞系 （包括ES 细胞等 ）/受精卵 （Zygote ） 中操作 ，因为效率还是比较高的。对于操作细胞系来说，结合单克隆挑取，往往可以获 得 100%的矫正。对于小鼠受精卵注射操作，也可以达到50%的效率（被矫正的后代占 全部后代的百分比）(2, 3)。已有报道AAV 介导的 spCas9 在小鼠的脑内可以有效编辑 目的基因(4) ，但对于成年动物其他组织的矫正则未必能 work 。虽然现在有更小的 Cas9-saCas9 可以被包装成AAV 高效特异性的导入到小鼠某个组织或者器官，但由于编 辑工具的局限性整体效果往往并不理想(5, 6) ；再加上同源重组的效率会进一步降低