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UltimateTM Column for Ultimate Performance Welch Materials, Inc. 色谱分离的基本原理 色谱方法的分类 液相色谱分离方法大致可以分为正相色谱、反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱、体积排除色谱、亲和色谱以及手性色谱。 在高效液相色谱法中，目前应用得最广泛的是正相色谱和反相色谱，其中反相色谱又是重中之中。 色谱分离原理 正相色谱的分离原理：根据溶质极性的不同而产生的溶质在吸附剂上吸附性强弱的差异而分离。 反相色谱的分离原理：根据因溶质疏水性的不同而产生的溶质在流动相与固定相之间分配系数的差异而分离。 色谱分离效果图 高效液相色谱仪的分析原理 高效液相色谱仪的结构 色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理 高效液相色谱柱发展史 19世纪70年代中期，HPLC仪开始出现，主要填料：10 μm 的无定型硅胶颗粒。 70年代后期，发展了反相液相色谱。 80年代，HPLC 被广泛应用于化合物的分离，主要填料：粒径为5 ～ 10 μm 球形硅胶。 90年代早期，粒径为 5 μm 的高纯硅胶，即所谓的 B 型硅胶被发展，并成为这个行业填料的标准，这种 B 型硅胶含有微量的金属。 90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了 3 μm 或 3.5 μm 的球形硅胶，其作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。 21世纪早期，为适应超快速的分离要求，粒径小于 2 μm 的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。 目前，市场上流行的分析用的 HPLC 硅胶基质填料主要为 B 型硅胶。 HPLC色谱柱及其填料的特征 HPLC 色谱柱的基质材料 硅胶与聚合物 现代高效液相色谱填料的特征 色谱柱结构 固定相 键合相 色谱柱接头 键合相稳定性 硅胶基质材料 目前应用最为广泛的基质材料。 高机械强度和高的比表面积。 可利用直接的广泛的表面键合反应来满足正相、反相、离子交换、疏水作用色谱和体积排除色谱的需求。 高效。 重现性好。 pH 适用范围为pH 2－8。 具有容易导致强碱性物质拖尾的，表面活性和带酸性的硅羟基。 聚合物基质材料 交联苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。 pH 稳定性好：pH 1－ 13。 可以在很宽的范围内进行表面化学处理以满足反相色谱、离子交换色谱、疏水作用色谱和体积排阻色谱的需求。 在中等 pH 条件下对强碱性物质具有更好的峰形。 填料的体积随着流动相的不同而改变，如膨胀或收缩。 分离效率相对硅胶而言比较低 重现性不好 硅胶外形的影响 无定型硅胶: 最初的 HPLC 填料 粒径 5 μm 柱床稳定性差 比表面积较小 价格便宜 硅胶纯度的影响 硅胶纯度对强极性化合物的分离最重要。 以前的纯度较低的硅胶（称为 A 型硅胶）, A 型硅胶是以金属硅酸盐制备而来，具有很高的金属含量，可被用作中性化合物和非离子化合物的分离。 纯度高、酸性较弱的硅胶 (称为 B 型硅胶)，这种硅胶是以无金属的工艺制备而来，只含有微量的金属，建议用于分离离子化合物和可电离的化合物，特别是碱性化合物。 金属杂质引起对螯合剂和碱性化合物的分离产生不对称峰或拖尾峰。 硅胶纯度的影响 硅胶孔径的影响 硅胶粒径的影响 HPLC 色谱柱的构成 键 合 相 键合相: 反相: 70%; C18, 65%; C8, 15%; Cyano, 5%, 苯基柱 5%, 正相: 20%; 硅胶、 -NH2、 -CN 其它 (手性柱, 离子交换柱): 10% 反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。 C18 和 C8 在反相色谱终应用得最为广泛。 为什么反相色谱应用如此广泛? 它能使中性化合物和极性化合物在一根色谱柱中得到分离。 适用于多种基体中的多类不同性质化合物的测定和分离。 保留时间可以用分子的疏水性进行描述和解释。 所用高纯度的水、甲醇和乙腈等溶剂价格便宜、实用。 选择性可通过用缓冲溶液进行调节（通过调节pH值来调节离子强度和胶团粒子大小等等），以实现最佳分离。 封 尾 封尾是用如三甲基硅烷等小分子与键合了C18以后的硅胶进行进一步的反应。 由于硅烷相对很大的体积，使得C18 和其它键合相在发生键合反应时只能覆盖不到硅胶表面的 50% 。 硅胶表面未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在中性条件下会对强碱性化合物产生严重的峰形拖尾。 封尾工艺使得表面残余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代。 封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离具有良好的峰形。