流式细胞仪FlowCytometry原理简介.PPT

流式细胞仪（Flow Cytometer)基础简介 中科院生物物理研究所 中国科学院蛋白质科学研究平台 2005年3月 刘春春 主要内容 流式细胞仪概要 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪测量的对象 什么是流式细胞仪 流式细胞仪基本结构 ●FCM的定义 流式细胞仪是指，使细胞（或其他粒子）以单个方式依次高速通过激发光束，采集细胞被光照时产生的各种信号，对信号进行处理，并对各参数进行关联分析的一种仪器。 对比 流式细胞仪是一种特殊的显微镜 功能特点 （1）多参数定量分析每一个细胞； 　　（2）细胞分选； 高纯度：99%以上； 可分析小于1/10000比例的稀有细胞群； 单细胞克隆等。 应用领域 疾病诊断 生物学基础研究 环境监测 海洋微生物研究 农业领域应用 等等 流式细胞仪工作原理 数据处理 流式细胞仪产生的信号 非荧光信号 荧光信号 细胞分选 流式细胞仪的测量对象 大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围：0.2uM-300uM。 对象类型 细胞类型： （1） 高等真核细胞； （2）酵母； （3）细菌； （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。 流式细胞仪能够检测的细胞属性和组分举例 1）不需染色： 大小，胞浆颗粒度，细胞自发荧光，色素，细胞精确计数。 2）需染色或标记： 细胞组分： 细胞膜：流动性，通透性，膜电位 细胞内离子：H+（可检测PH值），Na+，K+，Ca2+（结合的和 自由 的）。 核酸：DNA含量，DNA成分，DNA合成，RNA，染色质结构等 总蛋白质 蛋白质分子间相互作用 抗原 细胞骨架成分 受体 生物物理所现有流式细胞仪 型号：BD FACSVantage SE 参数：分析10，000个/秒，分选7，000个/秒；激光：488nm，UV；四色荧光通道。 地点：1406 联系方式：电或 电子邮件lcc@moon.ibp.ac.cn * * ●流式细胞仪实物 BD FACSVantage BD-Calibur 流式细胞仪 显微镜 流动的细胞 静止的细胞样本 数量大 数量少 高速分选 样本难以再利用 细胞群体特征量分布 可以揭示细胞内部结构信息 流式细胞仪 蛋白胶 多参数 单参数 量化的分布 平均值 容易检测各个参数间的相关性 不容易 　（3）高通量（分析分选）． 　分析150，000个/ 秒 　分选100，000个/秒 70年代美国为攻克癌症而建造。 厂商： Becton-Dickson Coulter-Beckman DOCytomation 已成为一个几十亿美金的产业 流体动力学聚焦 流动室 激光聚焦 液流与光源 探测光路聚焦 二色镜 1 2 3 带通滤波片 光电倍增管 激光束 细胞 收集透镜 前向散射光 侧向散射光，荧光 光信号分离，导向，各探测通道PMT接收并转化为电信号。 光信号收集 FSC SSC FL1 FL2 FL3 对数 线性 线性 线性 对数 脉冲处理，模数转换 光信号 电信号 记录数据，显示结果 （面积，峰高，宽度） 颗粒度 细胞大小 散射光信号区分裂解后的外周血细胞群 荧光