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PCR诊断技术在生猪疾病诊断上的优缺点 生命科学学院 09动物科学 2009084543 叶兴洁 指导老师：戴爱玲 【摘要】：PCR技术以其敏感、特异、快速、准确的优点成为目前病毒学诊断、分子生物学实验最常用的技术之一，也是生猪病原检测和定型中最常用的技术。目前国内外已经建立了多种检测生猪疾病的PCR技术。 【关键词】：PCR 诊断 疾病 抗原 转录 PCR技术以其敏感、特异、快速、准确的优点成为目前病毒学诊断、分子生物学实验最常用的技术之一，也是生猪病原检测和定型中最常用的技术。目前国内外已经建立了多种检测生猪疾病的PCR技术。 一、PCR技术的基本原理 PCR基本原理及方法是依据体内细胞分裂中的 DNA半保留复制机理以及体内dNTP分子在不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链变成单链DNA；单链DNA与人工合成的引物退火以及在dNTP存在下，耐高温的DNA聚合酶使引物沿单链模板延伸成为双链DNA。PCR是由高温变性(denaturation)、低温退火(annealing)、适温延伸(ex— tension)等三个基本反应(称一轮循环)组成的反复循环过程。 ①高温变性，即在95℃高温下将所要扩增的靶基因或DNA双链解离成单链DNA； ②低温退火，即以单链DNA为模板在37℃～55℃低温下与人工合成引物按碱基配对原则相结合； ③延伸，在耐热TaqDNA聚合酶、M g2+、72℃、合适缓冲液、4种dNTP条件下合成互补DNA新链。整个 PCR过程一般只需30个循环。每循环一次，目的DNA的拷贝数加倍。由于前轮反应所扩增的DNA可作为后一轮反应的模板，因此最后扩增得到的DNA数量为Y=(1+x)n。式中Y为DNA的量，X为反应平均效率，n为PCR的循环次数。若反应的平均效率为100％，循环反应20次后，大约扩增了106倍。每循环一次仅需几分钟，因此在2-4小时内即可使DNA扩增106。通常在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现“平台效应”，产物的量不再增加。 二、PCR技术诊断的优点 　　传统的动物疫病诊断方法有临床学诊断、生物学诊断、形态学诊断和免疫学诊断。随着分子生物学知识的不断积累，可能采用各种分子生物学技术直接探查病原体基因的存在和变异，从而对生物体的状态和疫病作出诊断，这就是基因诊断。在多种多样的基因诊断技术中，PCR因其巧妙的原理和与众不同的特点，已成为基因诊断的首选技术。现将其主要优点介绍如下： 　　1. 特异性高针对性强 不仅可以检出正在繁殖生长的病原体，也可以捡出潜伏的病原体；既能确定既往感染，也能确定现行感染。尤其对那些目前尚不能体外培养和难以培养的病原体，采用PCR检测特别有效。PCR技术是检测病原体的核酸，与生物化学和免疫学检测相比较，PCR结果与病原体培养结果更为一致。 　　2. 灵敏度高 在PCR扩增中，靶序列的数目以指数极增长，样品中级微量的靶序列在数小时内即可增至几十万，甚至几百万倍，因此该方法的检测灵敏度极高。理论上推算可以检出一个细菌或一个真核细胞的单拷贝基因的存在。 　　3. 简便快速 尤其是耐热TaqDNA聚合酶的应用和自动热循环仪的发展，使手工操作被自动化PCR取代。商品化试剂盒的发展和应用，使检测可在2－4小时内获得结果。 　　4. 对检测样品的要求低 几乎所有的临床标本都可以作为PCR的材料。对病原微生物的检测，只要求标本中有完整的靶序列核酸。因此，无论是经过远途运输或低温保存多年的陈旧标本，还是慢性或隐性感染的病料，都可以用于PCR扩增。 　　5. 安全检测病原体 由于PCR操作的每一步都不需要活的病原体，不会造成病原体逃逸，在防止传染病扩散意义上具有安全性。 6. 常规PCR以提取样品病原DNA为模板，在事先设计的引物、dNTP混合液、PCR反应液、Tap酶和镁离子等条件下进行的PCR反应。根据是否有扩增产物、扩增产物是否与预测的目的基因片段一致对疫病进行诊断。 7.标记PCR以4种dNTP为原料，将其中一种脱氧单核苷酸用放射性同位素、生物素或地高辛等标记，经 PCR扩增后，可获得大量纯度高的PCR产物，直接作为核酸杂交的探针用于疫病的诊断。 8.反向PCR用于扩增位于已知序列两侧的一段未知序列。先用一种能酶解已知序列侧面的限制性内切酶消化已知序列，再利用T4DNA连接酶使具有黏性末端的未知序列环化，然后用另一种限制性内切酶再切开已知序列，经过上述线状一环状一再线状的变化，使原位于已知序列两侧的未知序列变为位于已知序列的中央，这样经 PCR扩增便可测得未知序列。利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。 9.不对称PCR采用不等量的一对引物