CCK-8的步骤.docxVIP

人胆囊收缩素/缩胆囊素八肽（CCK-8）ELISA预期应用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中CCK-8含量。?实验原理用纯化的CCK-8抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的CCK-8抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（TMB）显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的CCK-8呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（ 值），计算样品浓度。?试剂盒组成及试剂配制 1、 酶标板：一块（96孔）2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为50 pmol/L，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成50 pmol/L，25 pmol/L，12.5 pmol/L，6.25 pmol/L，3.12 pmol/L，1.56 pmol/L，0.78 pmol/L，样品稀释液直接作为空白孔 0 pmol/L。如配制25 pmol/L标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）50 pmol/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。3、 样品稀释液：1×20ml。4、 检测稀释液A：1×10ml。5、 检测稀释液B：1×10ml。6、 检测溶液A：1×120 /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液A 1:100稀释（如：10 检测溶液A / 990 检测稀释液A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100 /孔），实际配制时应多配制? 0.1-0.2ml。7、 检测溶液B：1×120 /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。8、 底物溶液：1×10ml/瓶。9、 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。10、终止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。11、覆膜：5张12、使用说明书：1份???自备物品 1、 酶标仪（建议仪器使用前提前预热）2、 微量加液器及吸头，EP管3、 蒸馏水或去离子水，滤纸?标本的采集及保存 1、 血清：全血标本请于室温放置2小时或4 过夜后于1000 g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。2、 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于 1000 g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。3、 其它生物标本：请1000 g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保??? 存，但应避免反复冻融。?注：以上标本均应密封保存，4保存应小于1周，-20不应超过1个月，-80不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。?操作步骤实验开始前，各试剂均应平衡至室温，试剂不能直接在37 溶解；试剂或样品配制时，均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。1、 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100 ，余孔分别加标准品或待测样品100 ，注意不要有气泡，加样 时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37 温育2小时。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。2、 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100 （临用前配制），酶标板加上覆膜，37 温育1小时。3、 弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分钟，大约400 /每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。4、 每孔加检测溶液B工作液（临用前配制）100 ，加上覆膜，37 温育1小时。5、 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。6、 每孔加底物溶液90 ，酶标板加上覆膜37 避光显色（反应时间控制在15-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。7、 每孔加终止溶液50 ，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物??? 液的加入顺序相同。8、 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（ 值）。?注：1、 试剂准备：所有试剂在使用前应平衡至室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。2、 加样：加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及